韋恩·亨特

蜜蜂細胞培養(yǎng)基（西方蜜蜂膜翅目蜜蜂科）

韋恩·亨特

媒介在膜翅目昆蟲細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的研究已趨成熟，如蜜蜂（膜翅目蜜蜂科）。用蜜蜂幼體或蛹作為初始材料，并用改進的Hert-Hunter 70培養(yǎng)基已經(jīng)培育出多種蜜蜂細胞。蜜蜂細胞培養(yǎng)體系可以解決阻礙屏蔽分離群落中病原菌的困境，而這些病原菌可能會引起蜂群混亂、大批死亡。從蜜蜂的幼體到早期蛹的多個生命階段，從頭部、胸部、腹部的組織均已成功建立細胞培養(yǎng)。懸浮，貼壁以及類似上皮單層細胞等多種類型的蜜蜂細胞已經(jīng)培養(yǎng)出來了。WH2剛開始是為培養(yǎng)半翅目昆蟲，如亞洲柑桔木虱、葉蟬、Homalodisca vitripennis細胞培養(yǎng)，后來發(fā)現(xiàn)它同樣適用于其他很多不同種昆蟲，比如蜜蜂。蜜蜂細胞培養(yǎng)隨溫度在21～23℃變化下增加9～15天的時間。在初期離體培養(yǎng)組織中檢測到蜜蜂殘翅畸形病毒，用反轉(zhuǎn)錄PCR檢測出以色列急性麻痹病毒（IAPV），但是沒有檢測到克什米爾病毒（蜜蜂急性麻痹病毒）和黑蜂王臺病毒。用IAPV接種佛羅里達地區(qū)的蜜蜂樣本，在經(jīng)歷兩次傳代培養(yǎng)后仍能檢測到IAPV病毒。膜翅目昆蟲如蜜蜂細胞培養(yǎng)的研究大大促進了蜂群崩潰失調(diào)病的研究可行性。

蜜蜂；蜂群崩潰失調(diào)癥（CCD）；膜翅目；葉蟬；木虱；病毒

CCD對于授粉蜜蜂是個嚴峻的問題。CCD研究的瓶頸之一就是缺少蜜蜂細胞培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)體系提供了快速評估病原菌感染作用及其在蜜蜂細胞生長與生存的影響。很多行業(yè)靠生產(chǎn)，利用活的昆蟲作為兩棲和爬行寵物的食物，利用寄生物做生物防控，比如利用蜜蜂授粉獲得食物和農(nóng)作物的增產(chǎn)。然而，蜜蜂或其他膜翅目授粉昆蟲中CCD現(xiàn)象引起巨大關(guān)注，因為養(yǎng)蜂業(yè)的存亡可是與國民食品安全緊緊相連的。寄生于害蟲的病毒性病原菌，不僅可以殺死害蟲還能傳播到其他昆蟲體內(nèi)。出于在人工條件下的研究和商業(yè)目的，在其他昆蟲群落里也已有過CCD研究。典型的病毒性感染癥狀包括強勢群落的前蛹期羽化為成年，然而，它們大多數(shù)剛發(fā)育為成年蜂的都不能存活。在運用環(huán)境基因?qū)W方法的深入研究下，發(fā)現(xiàn)了一種蜜蜂感染病毒，以色列急性麻痹病毒（IAPV）。據(jù)目前報道，蜜蜂易受17種不同的病毒侵害。它們也易受數(shù)種小孢子蟲侵害，其中小孢子屬尤其受關(guān)注。然而，蜜蜂病原菌因缺少細胞系而很難被找出，蜜蜂細胞培養(yǎng)恰好給研究者們提供了針對蜜蜂病毒和真菌類感染在CCD中的作用這樣一些非常棘手的難題的解決方法。蜜蜂細胞體系的進一步應(yīng)用可以解決受阻困境，更好地闡明病原菌對蜜蜂CCD的影響和作用。

1.蜜蜂幼蟲和蛹的細胞

利用當?shù)厣a(chǎn)商提供的一個封蓋的育王框巢脾，用尖頭醫(yī)用鑷子將未封蓋的幼蟲和封蓋巢房里的蛹小心取出。這些白色幼蟲都帶有剛剛長出的頭。初期階段的蛹，眼睛白色，完全發(fā)育并具有棕褐色眼睛的頭部，他們選擇了那些眼睛為深褐色的蛹。在消毒過的,層流凈化罩中,用70%乙醇對蜜蜂體表消毒，輕輕震蕩10分鐘。每2分鐘用0.22 μm膜過濾的水進行清洗。用無菌鑷子分開其頭部，胸部，腹部。在室內(nèi)溫度為22℃下，蜜蜂組織在WH2培養(yǎng)基中切分并分至24孔板，每個孔內(nèi)少放組織為宜，腹部組織被分散至四個分開的平板。一般在4～10天時間，細胞呈現(xiàn)持續(xù)生長，接下來每隔7～12天更換一下1/3的培養(yǎng)基。懸浮的細胞和殘骸被轉(zhuǎn)移至25 cm2的組織培養(yǎng)瓶中，觀察新細胞48小時內(nèi)生長情況。

2.培養(yǎng)基和添加劑

蜜蜂細胞培養(yǎng)基WH2的組成是由木虱細胞培養(yǎng)基HH-70稍作修改而成。昆蟲培養(yǎng)基代替培養(yǎng)基199。在WH2培養(yǎng)基中24小時內(nèi)可以看到接種的組織貼壁生長，L-谷氨酸的添加與否不影響細胞的生長，因此實驗最后沒添加L-谷氨酸。L-glutamine WH2培養(yǎng)基的成份見表1。慶大霉素被用作抗生素。針對含有個別培養(yǎng)基配置而成的商業(yè)化的可用培養(yǎng)基的篩選，每隔8天對細胞的貼壁生長情況進行觀察。加有10%胎牛血清的培養(yǎng)基之后，分別檢測蜜蜂細胞在HH-70木虱細胞培養(yǎng)基生長情況，再觀測和在Sf-900TMIII SFM中無10%胎牛血清的培養(yǎng)基的蜜蜂細胞的生長情況。試驗顯示，細胞生長緩慢，呈半透明，通常觀察到的是以單個細胞形式存在。細胞在Ex-Cell 405能存活，但細胞貼壁和生長速率極慢，處于一個非常低的頻率。將HH-70中其他的成分作為細胞培養(yǎng)基，蜜蜂細胞可以存活，但沒有貼壁生長。

3 .細胞系檢測

通過PCR，利用蜜蜂特異性引物與肌動蛋白進行分析。從細胞培養(yǎng)和成年蜂中提取其染色體DNA，提取方法：AquaPureRGenomic DNA Kits(BIO-RAD,Hercules,CA)。PCR試驗是用PlatinumRPCR Super-MixTM，反應(yīng)條件是：95℃，3分鐘；95°C，30秒，60℃，30秒；72℃，30秒，30個循環(huán)；最后72℃下維持5分鐘，從而得到提取物。葉蟬基因作為陰性對照。結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)和成年蜂中的肌動蛋白基因中擴增引物的大小和序列是相同的，但與木虱中的不同。

與Maori等.2009年的報道相類似，在培養(yǎng)體中，發(fā)現(xiàn)只有殘翅病毒被檢測到。接種過IAPV的細胞在數(shù)次繼代培養(yǎng)后檢測仍呈陽性。在WH2培養(yǎng)基中培養(yǎng)蜜蜂幼蟲和蛹的細胞，24小時就能觀察到細胞貼壁蔓延生長。單層細胞是由類似葉蟬的兩種上皮細胞組成。細胞培養(yǎng)基都貼上“AmWH”標簽。這種梭狀的細胞，1～2 μm寬，2.5～10 μm長，形成細胞簇。懸浮培養(yǎng)出的是圓形細胞，直徑為1～2 μm。盡管以前培養(yǎng)基評估中有2 mM L-谷氨酸，然而此評估顯示L-谷氨酸的有無對細胞生長沒有影響，但是來自草地夜蛾的鱗翅類細胞系在谷氨酸鹽缺乏的培養(yǎng)基上不能生長。

如今，擁有可以提供蜜蜂細胞生長的培養(yǎng)基，為研究者提供了極需的研究工具，而它將在圍繞引起膜翅目授粉昆蟲的CCD原因和針對CCD獲得可行性的解決辦法具有重要意義。蜜蜂細胞培養(yǎng)同樣提供了一個在蜜蜂繁殖中病毒感染的高度防控體系，對其在蜜蜂病毒病理學(xué)上的進一步研究具有重要意義。

注：蜜蜂細胞培養(yǎng)基WH2成分

Schneider's Insect Medium 150 ml

0.06 ML-histidine solution(pH 6.35)200 ml

Fetal Bovine Serum(heat inactivated)a 50 ml

CMRL 1066 15 ml

Hanks'Salts 5 ml

Insect medium supplement(×10)2 ml

Gentamicin,units/1 μl/ml

培養(yǎng)基總?cè)萘?22 ml；用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH在6.3～6.5范圍中

56°C胎牛血清熱處理30分鐘

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所 汪天澍 余林生譯