伯曉晨，楊 靜，王升啟

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

病毒性疾病嚴(yán)重危害人類健康，歷史上幾次全球范圍的病毒性疾病流行給人類帶來了深重的災(zāi)難。近年來，甲型H1N1流感、高致病性禽流感、SARS病毒等的肆虐造成了極大的社會恐慌和難以估算的經(jīng)濟(jì)損失;病毒性生物恐怖劑制備技術(shù)的普及對人類安全構(gòu)成了潛在威脅。雖然抗病毒藥物在近20年來有了很大發(fā)展，目前在臨床應(yīng)用的抗病毒藥物已達(dá)40多種，但許多重要病毒性疾病仍然缺乏有效的治療藥物[1]。

由于病毒基因組編碼的蛋白數(shù)量非常少，以病毒蛋白為靶標(biāo)的抗病毒藥物在靶標(biāo)選擇上受到很大限制[2－4]。更為重要的是，病毒通過頻繁變異極易適應(yīng)和逃避藥物施加的選擇壓力，解決病毒耐藥問題成為抗病毒藥物研究和開發(fā)的關(guān)鍵[3]。此外，由于不同種類的病毒蛋白結(jié)構(gòu)差異較大，以病毒蛋白為靶的藥物很難實現(xiàn)廣譜[2－3]。近年來，宿主靶向和宿主－病毒聯(lián)合靶向策略成為抗病毒藥物研究的重要發(fā)展方向[5－9]?；诟咄坎《靖腥窘M學(xué)實驗和計算系統(tǒng)生物學(xué)方法構(gòu)建病毒－宿主分子相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以為從系統(tǒng)水平上辨識抗病毒藥物宿主靶標(biāo)提供重要基礎(chǔ)。

1 宿主靶向抗病毒策略與宿主靶標(biāo)辨識

由于病毒是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生物，理論上可以通過抑制與病毒生存密切相關(guān)的宿主蛋白來達(dá)到抗病毒的目的。事實上，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的相關(guān)研究已經(jīng)為宿主靶向抗病毒策略提供了很多啟示，宿主細(xì)胞的基因在自然突變導(dǎo)致功能喪失后，往往可以使宿主避免某種病毒的感染。如HIV研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生趨化因子受體 5(C－C－motif receptor 5，CCR5)基因突變的人對HIV具有天然免疫性[10]，CCR5隨即成為抗HIV藥物的熱點宿主靶分子，其拮抗劑Maraviroc(馬拉維若)也通過了美國食品及藥物管理局的批準(zhǔn)并用于臨床[11－12]。最新報道的 CCR5 拮抗劑 TD－0680 在抗病毒活性上比Maraviroc高出幾十倍，能廣泛用于抑制不同類型的人和猴艾滋病毒[13]。

宿主靶向抗病毒策略的一個突出優(yōu)勢是宿主細(xì)胞提供了遠(yuǎn)比病毒豐富得多的候選藥物靶標(biāo)。而且，由于人基因的突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于病毒基因，宿主靶向策略還可以比較好地解決耐藥問題[5]。除此之外，由于多種病毒可能會作用于相同的宿主蛋白，因此，宿主靶向藥物有可能具有廣譜抗病毒活性[2]。

宿主分子靶向的思想在抗痘病毒、皰疹病毒、肝炎病毒和蟲媒病毒藥物研究中也得到了應(yīng)用。如靶向人ab1酪氨酸激酶的藥物Gleevec通過阻斷牛痘病毒A36R蛋白的磷酸化可以治療牛痘病毒感染[14]，靶向維生素K2轉(zhuǎn)移酶的抑制劑可治療丁型肝炎病毒(HDV)感染[15]，靶向組蛋白去乙?；窰DAC1可抑制 HIV的基因表達(dá)[16]，阻斷 eIF－2α的去磷酸化可抑制單純皰疹病毒(HSV)的復(fù)制[17]等等。特別是在丙型肝炎病毒(HCV)感染治療藥物的研究中，發(fā)現(xiàn)了一系列具有重要價值的潛在宿主靶標(biāo)，如親環(huán)素[18]、人熱應(yīng)激蛋白70[19]、載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽樣蛋白3G[20]、microRNA－122[21]等。

宿主靶向抗病毒策略要解決的一個重要問題是如何在大量的宿主細(xì)胞蛋白中選擇特異并低毒的抗病毒靶標(biāo)。宿主靶標(biāo)的辨識必須建立在對病毒－宿主相互作用網(wǎng)絡(luò)的全面和深刻認(rèn)識上。各種組學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的興起，為系統(tǒng)揭示病毒－宿主分子相互作用網(wǎng)絡(luò)提供了有力的實驗和理論工具，通過病毒感染轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、病毒－宿主蛋白相互作用組學(xué)、大規(guī)模RNAi文庫和計算系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)挖掘病毒感染、致病的關(guān)鍵宿主分子成為是近年來宿主靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)的主要手段。

2 病毒－宿主相互作用相關(guān)組學(xué)

近年來，病毒感染相關(guān)組學(xué)的研究揭示病毒和宿主在分子水平上存在廣泛而復(fù)雜的相互作用，引發(fā)了對于病毒－宿主分子相互作用網(wǎng)絡(luò)研究的關(guān)注和“病毒－宿主相互作用組學(xué)”的提出[8，22－25]。

2.1 病毒感染蛋白質(zhì)組學(xué)

病毒感染蛋白質(zhì)組學(xué)是隨著蛋白質(zhì)組技術(shù)在病毒研究領(lǐng)域的應(yīng)用而興起的，許多重要病毒如 HIV[26]，HCV[27]，SARS[28]，流感病毒[29]等感染前后的差異蛋白質(zhì)組相繼被揭示。在研究方法上，從最初的2－D電泳到最近基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組在病毒感染中的應(yīng)用越來越廣泛[30]。Zhang等[28]利用細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)與質(zhì)譜聯(lián)用的策略比較了SARS－CoV復(fù)制子細(xì)胞與其平行的 BHK21細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)BAG3是抑制SARS－CoV RNA復(fù)制的關(guān)鍵宿主蛋白;Go等[31]應(yīng)用ICAT技術(shù)分析被flock house virus感染的果蠅，共鑒定到1500個宿主蛋白，包括150個上調(diào)蛋白及66個下調(diào)蛋白。

考慮到病毒感染、復(fù)制過程的復(fù)雜性，上述這些靜態(tài)、單一的差異蛋白質(zhì)組發(fā)現(xiàn)方法提供的信息有限，不能系統(tǒng)地反映病毒與宿主相互作用的動態(tài)變化，缺乏全景式描述。需要能夠分不同時間、不同組織和細(xì)胞的不同細(xì)胞器進(jìn)行亞細(xì)胞定量蛋白質(zhì)組學(xué)的縱深研究[32]。采用亞細(xì)胞分離蛋白不僅降低了樣品的復(fù)雜性、有利于提高質(zhì)譜數(shù)據(jù)的可靠性，而且還可以提供許多蛋白移位穿梭的信息。最近有研究[29]利用高通量亞細(xì)胞動態(tài)定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了流感病毒感染人原代巨噬細(xì)胞早期宿主細(xì)胞的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)多達(dá)1000種蛋白表達(dá)出現(xiàn)差異并監(jiān)測到多種細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核蛋白出現(xiàn)移位，發(fā)現(xiàn)P2X7、Src和溶酶體蛋白滲漏是流感病毒感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)的三個關(guān)鍵效應(yīng)分子或通路，為流感病毒感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)提供了一個全景式網(wǎng)絡(luò)圖譜。

2.2 病毒－宿主蛋白相互作用組學(xué)

高通量蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)的進(jìn)步為從系統(tǒng)水平上考察病毒－宿主分子相互作用奠定了重要實驗基礎(chǔ)。2006年以來，國際上一些知名刊物如Science，PNAS，MSB等先后報道了通過酵母雙雜交技術(shù)得到的 KSHV，VZV，EBV，SARS－Cov，HCV，DENV等重要病毒與宿主之間的蛋白相互作用圖譜[33－37]。

2.3 病毒感染依賴的關(guān)鍵宿主因子

大規(guī)模RNAi文庫是后基因組時代研究基因功能、特別是發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)的重要工具。通過系統(tǒng)地沉默宿主基因，并觀察基因沉默后的病毒感染情況，可以發(fā)現(xiàn)病毒感染過程依賴的關(guān)鍵宿主蛋白，即關(guān)鍵宿主因子(essential host factor)。采 用 該 策 略 先 后 完 成 了 針 對 HCV[38－39]、DENV[40]、WNV[41]、流感病毒[42－44]、HIV[45－47]等重要病毒的大規(guī)模關(guān)鍵宿主因子篩選，為宿主靶標(biāo)的挖掘提供了非常重要的線索。

2.4 病毒－宿主相互作用中的宿主miRNA

miRNA作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子參與到人體發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等諸多生物學(xué)過程。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的人編碼的miRNA前體已達(dá)721條。最近的研究表明，人編碼的miRNA在病毒－宿主相互作用中也扮演著重要角色。挖掘病毒感染和致病依賴的宿主miRNA對以miRNA及其調(diào)控分子為靶的抗病毒藥物設(shè)計具有重要的意義。宿主miRNA參與的病毒－宿主相互作用有多種模式。

首先，作為機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)的重要補(bǔ)充，宿主編碼的一些miRNA可以直接靶向病毒，并在病毒感染的早期發(fā)揮重要的抗病毒作用。Lecellier等[48]預(yù)測并證實了人類泡沫病毒基因組開放閱讀框架2中的一個區(qū)域可能是人源miR－32的靶標(biāo)，miR－32基因的表達(dá)可有效的抑制人類泡沫病毒的復(fù)制。研究還發(fā)現(xiàn)[49]過表達(dá)的miR－199a*可以顯著的降低HCV－1b和HCV－2a的復(fù)制，并且其靶向的5'UTR區(qū)域在所有HCV基因型中是高度保守。Hariharan等[50]采用一致性得分的方法對靶向HIV的miRNA的進(jìn)行了預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了5種人源miRNA可以靶向病毒的關(guān)鍵基因，分別是:hsa－mir－29a 和 29b 可以靶向 nef 基因，hsa－mir－149 靶向vpr基因，hsa－mir－378 靶向 env 基因，hsa－mir－324－5p 靶向vif基因。這是首次報道可以靶向 HIV基因的人源miRNA的存在，它們可能在延緩HIV感染中起到非常重要的作用。

其次，病毒可以通過調(diào)節(jié)人源miRNA的表達(dá)可以廣泛調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)水平，比如增加利于自身復(fù)制的聚合酶的表達(dá)，減少對自身不利免疫因子的表達(dá)。由于miRNA在轉(zhuǎn)錄水平即可發(fā)揮調(diào)控功能，因此病毒對宿主miRNA的調(diào)控有利于其實現(xiàn)對宿主細(xì)胞狀態(tài)的快速、高效調(diào)節(jié)，這一作用模式可能廣泛存在于各種病毒中，它的闡明對于理解病毒如何利用自身有限的基因組調(diào)節(jié)人體細(xì)胞復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。這種模式已經(jīng)在HIV中得到了證實[51]，在 HIV 感染過程中，人源的 miR－17－5a和 miR－20a均被下調(diào)表達(dá)，從而導(dǎo)致兩者在體內(nèi)的靶標(biāo)PCAF表達(dá)增加，而PCAF恰好是對HIV的感染有重要作用的Tat的輔助因子，使HIV的感染得到了增強(qiáng)。在病毒感染過程中常伴隨著人體細(xì)胞中一系列基因的上調(diào)和下調(diào)，這些基因的產(chǎn)物又會影響其他基因的表達(dá)，最終引起細(xì)胞功能狀態(tài)的改變。

此外，宿主miRNA可能與干擾素的抗病毒作用有密切關(guān)系。干擾素具有抗病毒的作用早已為人知曉，但其具體機(jī)制卻仍然沒有完全揭示，目前的研究認(rèn)為干擾素是通過調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒的作用[52－53]。Pedersen等[54]則發(fā)現(xiàn)干擾素的抗病毒作用與miRNA有密切關(guān)系，干擾素可引起人細(xì)胞內(nèi)一系列miRNA的表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，其中5個miRNA在HCV的基因組中有相應(yīng)的作用靶點，用它們的模擬物處理HCV感染細(xì)胞重現(xiàn)了干擾素作用的效果，而用反義寡核苷酸對干擾素產(chǎn)生的miRNA進(jìn)行中和后則使干擾素的抗病毒效果顯著降低。這些結(jié)果表明，干擾素可發(fā)動具有抗病毒作用的miRNA的表達(dá)而發(fā)揮直接的抗病毒作用，miRNA在干擾素作用機(jī)制中可能發(fā)揮著核心的作用，不過干擾素是否對其他病毒有類似的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的證實。

3 病毒－宿主分子相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

隨著實驗數(shù)據(jù)的快速積累，病毒－宿主分子相互作用呈現(xiàn)出越來越復(fù)雜的趨勢，通過簡單的邏輯分析很難把握這種復(fù)雜性。在此背景下，采用計算系統(tǒng)生物學(xué)方法構(gòu)建和分析病毒－宿主分子相互作用網(wǎng)絡(luò)、辨識病毒感染的關(guān)鍵宿主分子和通路成為重要的研究方向。

3.1 病毒－宿主分子相互作用的生物信息資源

在病毒－宿主分子網(wǎng)絡(luò)方面的兩個專業(yè)數(shù)據(jù)庫是VirHostNet[55]和 VirusMINT[56]。另外，在病原微生物和宿主相互作用數(shù)據(jù)庫 PHI－base[57]和 PHIDIAS[58]中，也包含了部分病毒－宿主分子相互作用數(shù)據(jù)。

VirHostNet是目前比較全面的綜合性病毒－宿主分子相互作用數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)部分來自人工的文獻(xiàn)挖掘和校對，部分來自其他相關(guān)數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容包含了病毒自身蛋白質(zhì)之間、病毒－宿主蛋白質(zhì)之間及宿主自身蛋白質(zhì)之間三部分的相互作用信息，共涉及7個病毒類、51個病毒科、222種病毒的1660個病毒蛋白。其中，病毒－人之間的蛋白相互作用共5207對，包含2189個人的蛋白和675個病毒蛋白，涉及31個病毒科、180種或亞種病毒。

通過對VirHostNet中收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步分析可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前對病毒的研究數(shù)據(jù)主要集中在雙鏈DNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單鏈RNA病毒這三類病毒，其相關(guān)數(shù)據(jù)占數(shù)據(jù)庫總數(shù)的90%以上;而對雙鏈RNA病毒和Delta病毒的研究較少，相關(guān)數(shù)據(jù)僅占總數(shù)的0.3%。VirHostNet中的數(shù)據(jù)存在較大偏性，HIV，HCV，HPV，AAV，HB等被研究較多病毒的相關(guān)數(shù)據(jù)占了絕大多數(shù)，在進(jìn)行大范圍分析時需要進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)上的校正。

3.2 基于基因表達(dá)譜構(gòu)建病毒感染激活網(wǎng)絡(luò)

近年來，將動態(tài)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和靜態(tài)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合分析的方法得到了快速發(fā)展，這種整合分析可以為蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)加上時空約束，更加適合分析具體的生物醫(yī)學(xué)問題。目前在 GEO[59]，ArrayExpress[60]等數(shù)據(jù)庫中存儲了大量病毒感染相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，利用這些表達(dá)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合人蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，可以通過計算手段快速構(gòu)建病毒感染激活的宿主蛋白網(wǎng)絡(luò)。

李非等[61]基于該思路提出了一種病毒感染激活子網(wǎng)構(gòu)建方法，該方法融合了基因表達(dá)的差異性和相關(guān)性信息，采用了模擬退火迭代搜索算法，能夠在已知的宿主蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中辨識高功能相關(guān)度的病毒感染激活子網(wǎng)。該算法可以有效避免僅考慮基因表達(dá)差異性所引入的偏差，揭示了高相關(guān)性低表達(dá)差異基因在相關(guān)通路中的關(guān)鍵性作用。應(yīng)用該算法構(gòu)建HIV感染激活子網(wǎng)，經(jīng)過4次迭代后，子網(wǎng)中有39%為文獻(xiàn)報道的HIV相關(guān)分子，證明了算法的有效性。

3.3 大范圍病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

為了挖掘病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中蘊(yùn)含的一般規(guī)律，一些研究將各種代表性病毒和宿主的相互作用集成起來，在整體水平上考察病毒－宿主分子相互作用網(wǎng)絡(luò)的各種性質(zhì)。

Dyer等[62]通過對病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，與病毒感染密切相關(guān)的宿主蛋白多為網(wǎng)絡(luò)中的“集線器(hub)分子”和“瓶頸(bottleneck)分子”。從復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的角度看，這些結(jié)果預(yù)示病毒對宿主分子網(wǎng)絡(luò)具有很強(qiáng)的影響乃至控制能力。從功能上看，病毒所涉及的宿主分子大多集中在細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡、核轉(zhuǎn)運(yùn)等與病毒生活周期密切相關(guān)的通路上。Navratil等[62]對病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的靜態(tài)拓?fù)浜吞摂M擾動分析不僅得到了類似的結(jié)果，而且通過將病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)與疾病相關(guān)基因整合，發(fā)現(xiàn)了病毒感染和許多非傳染病疾病之間的廣泛聯(lián)系。

4 挑戰(zhàn)與展望

與病毒－宿主蛋白相互作用數(shù)據(jù)的積累相比，以此為對象的系統(tǒng)生物學(xué)研究工作還非常薄弱，已發(fā)表的結(jié)果大多是屬性關(guān)聯(lián)分析和靜態(tài)拓?fù)浞治?，對病毒感染機(jī)制和宿主靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)的指導(dǎo)價值還不夠。

病毒和宿主構(gòu)成了復(fù)雜的生命體系，病毒的生存策略不僅體現(xiàn)在病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的靜態(tài)圖譜上，更蘊(yùn)含于這一高度時空依賴的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的動力學(xué)行為中。但目前對于病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)動態(tài)模型及其應(yīng)用方面的研究還非常欠缺。從本質(zhì)上講，病毒蛋白與宿主蛋白發(fā)生相互作用取決于能否通過這種作用將網(wǎng)絡(luò)從感染前的正常狀態(tài)轉(zhuǎn)換為感染后更有利于自身生存的疾病狀態(tài)，而不取決于宿主蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)湫再|(zhì)。與病毒蛋白直接作用的宿主蛋白表現(xiàn)出來的拓?fù)淦允瞧鋭恿W(xué)性質(zhì)的一種折射。理想的宿主靶標(biāo)應(yīng)該是能夠通過對其施加局部控制將網(wǎng)絡(luò)由感染的疾病狀態(tài)扭轉(zhuǎn)為正常狀態(tài)。因此，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度看，宿主靶向抗病毒策略在本質(zhì)上就是針對病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的控制策略，而這種控制策略的獲得必須基于對病毒－宿主蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)動力學(xué)行為的深入揭示。

從最近報道的系統(tǒng)生物學(xué)研究進(jìn)展上看，將動態(tài)模型引入分子相互作用網(wǎng)絡(luò)可以得到一些對于藥物開發(fā)具有重要指導(dǎo)意義的結(jié)果，這些工作將為病毒－宿主分子相互作用網(wǎng)絡(luò)動態(tài)模型的構(gòu)建和應(yīng)用提供了重要參考，計算分析將在病毒－宿主相互作用研究和宿主靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮更加重要的作用。

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