張桂香，李春輝，齊潔敏，申興斌，莊新榮，馮振波

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，河北 承德 067000)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病呈上升趨勢。在其發(fā)病過程中抑癌基因的失活、突變和癌基因的異常激活發(fā)揮著重要的作用，基因的表達(dá)產(chǎn)物為蛋白。本研究應(yīng)用免疫組化法同步檢測子宮內(nèi)膜癌中PTEN、p53、hTERT三種蛋白的表達(dá)，旨在探討三者在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷、判斷預(yù)后以及靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料:選擇2011年1月至2012年12月經(jīng)病理結(jié)果證實Ⅰ型為子宮內(nèi)膜癌而入住我院接受手術(shù)治療的患者49例為研究對象，各患者術(shù)前均無放化療病史，年齡41－69(53.4±3.6)歲。子宮內(nèi)膜樣癌 G1期12例、G2期27例、G3期10例。子宮內(nèi)膜癌手術(shù)－病理分期 (按2009年FIGO標(biāo)準(zhǔn)):Ⅰ期34例(ⅠA期15，ⅠB期19例)、Ⅱ期10例，Ⅲ期4例，Ⅳ期1例。取同時間段因子宮肌瘤行子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜49例做對照。

1.2 試劑與免疫組化方法:PTEN鼠抗人單克隆抗體購自北京中山生物技術(shù)有限公司，hTERT兔抗人多克隆抗體及p53鼠抗人單克隆抗體購于福州邁新生物工程公司。免疫組織化學(xué)操作步驟如下:石蠟包埋組織連續(xù)切片4μm貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50min;石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟及100%、95%、90%、80%的梯度酒精脫水;3%H2O2孵育10min(室溫)封閉滅活內(nèi)源性過氧化酶;PBS沖洗5min，把切片放入0.01moL/L(pH6.0)枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行微波爐抗原修復(fù)10min;加正常山羊血清工作液進(jìn)行封閉，在37℃濕盒中溫育60min;滴加1∶100濃度一抗，37℃濕盒中溫育60min后，在濕盒中4℃過夜;PBS洗3×5min，滴加二抗，室溫孵育15min，再次PBS洗3×5min;取1mL蒸餾水加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，室溫顯色;蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復(fù)染，封片，觀察。以PBS替代一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 免疫組織化結(jié)果判斷:(×400)鏡下觀察，依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行綜合判定。其中染色強(qiáng)度分級:無著色為0分，淡黃為1分，黃或深黃2分，褐或棕黃3分。陽性細(xì)胞所占比例判定:陽性細(xì)胞計數(shù)＜10%為0分，10% －25%為1分，26% －50%為2分，51% －75%為3分，＞75%為4分;兩者相加＜2分為陰性(－)，2－3分陽性(+)，4－5分中等陽性(++)，6－7分強(qiáng)陽性(+++)。結(jié)果判定由兩名病理科主任醫(yī)師經(jīng)雙盲法獨立評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計數(shù)資料進(jìn)行X2檢驗，等級資料進(jìn)行秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PTEN、p53、hTERT在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌織中的表達(dá):PTEN陽性表達(dá)定位于胞質(zhì)，而hTERT、p53定位于細(xì)胞核。表達(dá)結(jié)果如表1所示。子宮內(nèi)膜癌組PTEN陽性率為40.8%，且以弱陽性為主，無強(qiáng)陽性表達(dá);而正常子宮內(nèi)膜組表達(dá)強(qiáng)度以陽性及強(qiáng)陽性為主，總陽性率97.9%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。p53在子宮內(nèi)膜癌組有19例(38.8%19/49)為陽性表達(dá)，而正常子宮內(nèi)膜組僅1例(2.0%1/49)為陽性表達(dá)，且為弱陽性，二者表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。hTERT在子宮內(nèi)膜癌組陽性率為67.3%，而正常子宮內(nèi)膜組無表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 PTEN、p53、hTERT在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

2.2 PTEN、p53、hTERT三者與子宮內(nèi)膜癌病理特征的關(guān)系:PTEN的陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的組織分級、FIGO分期(2009年)、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度呈負(fù)相關(guān)，即惡性程度越高、期別越晚，其表達(dá)越低。相反，p53、hTERT與子宮內(nèi)膜癌惡性程度、FIGO分期呈正相關(guān)。差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 PTEN、p53、hTERT陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌病理特征的關(guān)系

3 討 論

磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homo-Log PTEN)，是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因［1］，也是人類腫瘤中最易發(fā)生突變的腫瘤抑制基因［2］，于1997年首次被報道之后即成為研究熱點，是繼p53基因后另一個較為廣泛地與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的基因。其表達(dá)產(chǎn)物PTEN蛋白作為一種腫瘤抑制因子，通過阻止細(xì)胞生長和分裂的速度調(diào)控細(xì)胞分裂周期及細(xì)胞凋亡，因此PTEN蛋白一旦缺失，細(xì)胞則可發(fā)生異常增生甚至惡性變。另外，PTEN蛋白具有協(xié)助控制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞與周圍組織的粘附和血管發(fā)生的功能，因而與腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散相關(guān)。據(jù)報道PTEN基因缺失率在子宮內(nèi)膜癌中最高，32% －55%不等，故被視為子宮內(nèi)膜的“看家基因”［3］。本研究發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白在正常子宮內(nèi)膜組陽性表達(dá)率為97.9%，而子宮內(nèi)膜癌中僅為40.8%，下降了57.1%，非常接近國外報道的基因缺失率最高值;其陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的組織分級、FIGO分期(2009年)、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度呈負(fù)相關(guān)，換言之，隨著腫瘤惡性程度升高及進(jìn)展，其表達(dá)進(jìn)一步降低。這一結(jié)果說明PTEN蛋白的減少與子宮內(nèi)膜的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

p53是一種抑癌基因，但極易發(fā)生突變，故分為野生型和突變型兩種。其中野生型p53基因是一種抗癌基因，其表達(dá)的p53蛋白的半衰期很短，用免疫組化方法不易檢出。而突變型p53基因失去了修復(fù)DNA和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力，致使細(xì)胞過度增殖、凋亡減少以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［4，5］。其表達(dá)的突變型p53蛋白的半衰期延長，穩(wěn)定性高，在細(xì)胞核內(nèi)積聚，可用免疫組化方法檢測到。以此推斷本研究所測出的p53蛋白為突變型。本研究結(jié)果顯示在正常子宮內(nèi)膜組變異型p53蛋白僅1例(2.0%)表達(dá)為弱陽性，子宮內(nèi)膜癌組陽性表達(dá)率升高至38.8%(19/49)，并與子宮內(nèi)膜癌的組織分級、FIGO分期(2009年)、淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，這一結(jié)果與上述理論基礎(chǔ)相符。但用同一理論則無法解釋突變型p53蛋白與肌層浸潤深度無關(guān)的實驗結(jié)果，這可能與樣本較小有關(guān)，也可能與突變型p53蛋白在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展中的作用機(jī)制有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實。

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)被認(rèn)為是端粒酶的催化亞單位，是端粒酶活性表達(dá)的關(guān)鍵組分和限速因子［6］。而端粒酶的激活是細(xì)胞獲得永生化和(或)惡性變的重要機(jī)制。因此hTERT對細(xì)胞增殖、衰老、永生化及癌變起重要作用。本研究結(jié)果顯示正常子宮內(nèi)膜組無hTERT表達(dá)，而子宮內(nèi)膜組陽性表達(dá)率為67.3%，且42.9%為一般陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)。其陽性表達(dá)率與子宮內(nèi)膜癌的組織分級、FIGO分期(2009年)、淋巴轉(zhuǎn)移、肌層浸潤均呈正相關(guān)(P＜0.05)。然而國外研究表明hTERT在子宮內(nèi)膜癌組織中陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的組織分級相關(guān)，與FIGO分期無關(guān)［7］。也有研究顯示子宮內(nèi)膜癌組織hTERT強(qiáng)陽性表達(dá)率為80%－90%，且與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤及臨床分期呈正相關(guān)。雖然各家的報道不盡相同，但hTERT在子宮內(nèi)膜癌中高陽性表達(dá)率以及與組織分級呈正相關(guān)的觀點基本一致，這表明hTERT可作為子宮內(nèi)膜診斷及判定預(yù)后不良的標(biāo)記物應(yīng)用于臨床。與正常子宮內(nèi)膜相比，PTEN在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)減少，而p53及hTERT呈表達(dá)升高，三者均可作為子宮內(nèi)膜診斷及判定預(yù)后的標(biāo)記物。

［1］Erkanli S，Kayaselcuk F，Kuscu E，et al.Expression of survivin，PTEN and p27 in normal，hyperplastic，and carcinomatous endome －2 trium［J］.Int Gynecol Cancer，2006，16(3):1412 －1418.

［2］Mirantes C，Eritja N，Dosil MA，et al.An inducible knock－out mouse to model cell－autonomous role of PTEN in initiating endometrial，prostate and thyroid neoplasias［J］.Dis Model Mech，2013，2:8.

［3］Li L，Ross AH.Why is PTEN an important tumor suppressor［J］.Cell Biochem，2007，102(6):1368 －1374.

［4］遲元衛(wèi)，陳健，劉亮等.結(jié)腸癌中hTERT和p53蛋白表達(dá)及臨床意義［J］.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011，49(4):115 －117.

［5］Takeda T，Dong X，Take da H，et al.Successful immune therapy combined with hyperthermia therapy for cancer patients［J］.Gan To KagaKu Ryoho，2006，33(12):1739 －1741.

［6］Blackburn E H.Telomere states and cell fates［J］.Nature，2000，408(6080):53－56.

［7］Brustmann H.Immunohistochemical detection of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)，topoisomerase IIalpha expression，and apoptosis in endometrial adenocarcinoma and atypical hyperplasia［J］.Int Gynecol Pathol，200，24(2):184 －192.