趙寧 綜述 蔡莉 審校

在研究人員發(fā)現RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術不久后，在無脊椎動物、植物及哺乳動物中，用于全基因組范圍內遺傳篩選的RNAi文庫迅速發(fā)展起來，歷經了從早期的化學合成RNAi文庫到慢病毒RNAi文庫各個階段。由于RNAi文庫無法比擬的優(yōu)越性，目前已廣泛應用于腫瘤研究中。本文將從不同RNAi文庫的優(yōu)越性和局限性以及在腫瘤研究中的應用加以論述。

1 RNA干擾文庫的概念和發(fā)展

1970年分子生物學中心法則的定義使人們發(fā)現反義堿基配對可干擾基因表達，可最終應用于疾病的機理研究和治療[1]。1993年，人們發(fā)現一類非編碼微小RNA（microRNA, m iRNA）在真核細胞中充當主要的調控子[2]，加速了RNA研究的發(fā)展。1998年，第一個反義的藥物——福米韋生（Fom ivirsen），被食品和藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準治療巨細胞病毒視網膜炎[3]，與此同時，研究者在新秀麗小桿線蟲中發(fā)現了RNAi機制[4]，并因此榮獲2006年諾貝爾經濟學獎。RNAi的發(fā)現改變了基因調控的面貌，它在基因功能研究和疾病治療上也取得了新進展[5]。

RNAi文庫是人工構建的能通過誘導RNAi抑制眾多不同基因表達的混合文庫，可以用于建立功能缺陷（loss of function）的生物或細胞庫，進行表型的篩選。2000年RNAi文庫的產生是RNAi研究的一個重要飛躍[6,7]，其中在全基因組范圍內進行功能缺失的篩選，優(yōu)于之前采用的候選基因的方法。研究者利用RNAi文庫發(fā)現了許多與生物功能有關的新基因和治療疾病的新靶點，在基因功能研究領域邁出了重大的一步。在無脊椎動物[4]和植物[8]中，RNAi在轉錄后水平的基因沉默首先通過導入長的雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA），通常為幾百個核苷酸的長度，隨后進行宿主基因沉默/miRNA機制加工成功能性的小干擾RNA（small interference RNA, siRNA），通常為21個-25個核苷酸的長度。哺乳動物的RNAi由siRNA觸發(fā)：siRNA可以經化學合成后或由載體傳遞導入細胞，常用的載體有表達短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）前體的病毒載體[9]。SiRNA進入細胞后可以結合形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex,RISC），siRNA打開雙鏈激活RISC，激活的RISC通過堿基互補配對與對應的mRNA結合并進行降解?；谄洳煌募庸ぬ幚頇C制，研究者已經創(chuàng)建了各種類型的包括無脊椎動物、植物和哺乳動物的RNAi文庫。我們將全面探討RNAi文庫的發(fā)展：從早期的化學合成RNAi文庫到最近的慢病毒RNAi文庫，并對RNAi文庫在腫瘤研究方面的應用進行概述。

2 適用于不同對象的RNAi文庫

2.1 適用于無脊椎動物和植物的dsRNA文庫 高通量RNAi篩選最初出現在新秀麗小桿線蟲中[6,7]，指某一基因被沉默之后表型的改變。2000年一個針對近90%位于線蟲染色體I上已知基因的由細菌表達的長dsRNA文庫（2,445個獨立克?。┍皇状翁岢鯷6]，這是一個可重復使用的文庫，只需將細菌的克隆供給蠕蟲，便可以實現無限制的RNAi篩選，但它仍然只是RNAi文庫的雛形。在幾乎同一時間，一個針對線蟲第三染色體上23,000個開放閱讀框架的dsRNA庫被開發(fā)出來[7]。文庫構建的過程是首先對單個開放閱讀框進行PCR擴增，產生DNA模板，然后在體外轉錄產生dsRNA。最后，將這些dsRNA注入蠕蟲中進行功能分析就可以實現大規(guī)模篩選。不久，這些文庫擴大到覆蓋98%的線蟲基因組的已知基因[10]。類似的方法也適用于構建針對91%果蠅已知基因的dsRNA文庫[11]。但若應用于哺乳動物細胞中，長dsRNA直接轉染會引起細胞毒性反應，基因沉默效果差，因此不適用于哺乳動物細胞。

2.2 適用于無脊椎動物、植物和哺乳動物的短發(fā)夾RNA（shRNA）文庫 RNA干擾的另一個手段是載體（質粒）介導的shRNA的轉基因表達。shRNA能被細胞內的siRNA或miRNA處理為功能性的siRNA。RNA聚合酶III啟動子，如H 1或U6啟動子能啟動傳統(tǒng)的shRNA（相當于m iRNA的前體）的表達。在果蠅中，傳統(tǒng)shRNA方法已被廣泛使用，以產生轉基因RNAi株系并在這個物種的所有體細胞組織中應用。第二代shRNA，也稱為人工m iRNA（artificial microRNA, amiRNA），可由聚合酶II或聚合酶III啟動子轉錄[12]，是利用天然m iRNA作用原理設計的，以一個或多個特定基因為靶標的小RNA分子，能夠高效、特異地抑制基因的表達。在擬南芥中，基于amiRNA的高特異性基因沉默通過結構誘導或組織特異性聚合酶II啟動子[13]得以應用。在哺乳動物中，Hannon和Elledge構建了以小分子RNA為基礎的大型shRNA載體文庫，這些載體的靶點涉及人類和小鼠的很多基因；他們觀察到了比以前的shRNA文庫更為有效的基因抑制現象，促進了基因功能的研究。

2.3 適用于哺乳動物的siRNA文庫 在哺乳動物細胞中，長dsRNA往往觸發(fā)非特異性免疫，導致序列非特異性的蛋白表達下調，轉變?yōu)殚L度超過30 bp的非自身dsRNA，因此，siRNA（通常為21 bp）已經成為誘導哺乳動物RNAi的主要形式。在哺乳動物中的RNAi篩選開始于腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL）介導細胞凋亡的調控子的確認，TRAIL是TNF家族的一員，具有抗腫瘤的功能。Sonnichsen等[10]應用Dharmacon公司生產的針對510個基因的siRNA文庫轉染HeLa細胞，篩選出對TRAIL誘導細胞凋亡有調控作用的基因。Sonnichsen等[10]的篩選對了解TRAIL的作用機制和抗腫瘤藥物的開發(fā)有重要的意義。

目前構建siRNA文庫的方法主要有合成化學法和酶學工程方法，化學合成方法利用合成siRNA在高通量遺傳篩選方面進行研究，已常規(guī)用于哺乳動物細胞中。研究人員還發(fā)現了大量與癌癥功能、干細胞生物學和病毒感染有關的基因，促進人們進一步了解這些基因的病理生理過程。為了解決化學合成試劑和轉染試劑耗費大量費用的問題，研究者發(fā)現了酶學工程方法合成的siRNA（enzymatically prepared siRNA, esiRNA）文庫[14]。EsiRNA文庫起源于DNA模板（cDNA文庫或攜帶目的DNA的質粒文庫）并且被加工進入針對同一個mRNA序列的不同siRNA中，相對于化學合成siRNA文庫，效率更高。目前研究者將創(chuàng)建esiRNA文庫研究那些基因組還未被測序的生物。

化學合成的和esiRNA文庫的共同問題是轉染試劑伴隨大量的毒性反應。并且由于文庫的轉染效率很低，均不適用于原代細胞的篩選。因此，上述文庫均無法很好地應用于哺乳動物細胞中，而病毒載體的出現，有可能克服上述的難題[15]。

3 哺乳動物中由不同病毒載體介導的RNAi文庫

3.1 腺病毒文庫 腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA病毒，編碼基因組中分子量超過36 kb的40多種蛋白。腺病毒相對安全，易于擴增。目前腺病毒文庫已經廣泛的用于基因治療的臨床試驗中[15]，甚至被國內批準用于一些特定的腫瘤治療中，如p53基因的抗癌治療[16]。近來有復制缺陷的腺病毒載體用于傳遞編碼基因的蛋白質或siRNA[17]。SilenceSelect文庫就是基于帶有shRNA的腺病毒載體[18]，可用來沉默與人類疾病有關的藥物靶點。

腺病毒基因組相對較大，其宿主蛋白與載體間的非特異性干擾等原因限制了這種病毒在文庫篩選方面的應用。除此之外，腺病毒載體高表達的非編碼RNA，病毒相關RNA1和RNA2，可以作為競爭性底物使Dicer和RISC飽和，抑制RNAi通路，最終通過RNAi沉默機制進行干擾[19]。第三代腺病毒載體，其所有的病毒編碼序列都被非編碼DNA和復合序列所取代，理論上避免了上述這些問題[20]，但由于在載體的生成和加工方面的技術問題，并未得到大規(guī)模的應用。最為關鍵的問題是，腺病毒采用游離基因傳遞的方法只能引起瞬時轉基因表達。然而，研究者始終認為：腺病毒RNAi文庫依然是體內研究的一個重要選擇。

3.2 逆轉錄病毒文庫 逆轉錄病毒，比如基于Moloney小鼠白血病的病毒[21]，可以整合進入宿主細胞基因組，甚至可以長期在快速分裂的細胞中進行轉基因表達，相對于腺病毒文庫的瞬時轉基因表達是一個相當大的優(yōu)勢。因此，逆轉錄病毒文庫可以應用于RNAi領域中。Jensen等[22]從逆轉錄病毒文庫中篩選出高功能性和低功能性的shRNA莖環(huán)，對shRNA的設計有很重要的指導意義。然而，逆轉錄病毒文庫的不足之處是：轉染效率很低，只能轉染分裂期細胞，對于慢分裂細胞或有絲分裂后期的細胞，如神經元細胞，無法轉染。

3.3 慢病毒文庫 慢病毒載體從偽膜帶有VSV-G包膜蛋白質的人類1型免疫缺陷病毒中加工而來，與逆轉錄病毒和腺病毒載體相比，它的優(yōu)勢在于可以轉染分裂期和非分裂期的細胞，容納外源性基因片段大，可以長期穩(wěn)定表達。由于慢病毒載體廣泛的趨向性，可以整合入宿主細胞的基因組并在大多數細胞中高效轉染，不產生任何有效的細胞免疫應答，介導的轉基因表達能持續(xù)數月，在RNAi文庫中應用廣泛。最近由ThermoScientific、Cold Spring Harbor Library與美國哈弗大學合作開發(fā)了兩種慢病毒RNAi文庫，兩者的設計都基于miR-30-shRNA，分別用于shRNA的組成性表達和誘導性表達[23]。

由以上內容可知，逆轉錄病毒或慢病毒載體的RNAi文庫在體外的應用相對簡單，但是在體內的應用仍然處于瓶頸期。節(jié)約且可行的方法是在異種植皮術的動物中進行干細胞或癌細胞的體外轉導[24]，或在體外轉導胚胎干細胞，產生組織特異性或全身性的RNAi的轉基因老鼠[25,26]。然而，人們仍無法實現基因到基因的高通量篩選，也無法直接應用于體內，而這些仍需要研究人員進一步的探索。

4 RNAi文庫在腫瘤研究中的應用

4.1 尋找新型抗腫瘤藥物靶點中的應用 腫瘤治療的原則是阻止腫瘤細胞增殖，或使腫瘤細胞生長受到抑制甚至產生直接的細胞自殺性行為。而RNAi文庫就是利用細胞活力測定篩選出具有抑制腫瘤細胞增殖能力的細胞，進而發(fā)現抗腫瘤通路上的重要靶點?；诓《据d體介導的RNAi篩選系統(tǒng)特別適合在人類腫瘤細胞中進行基因功能分析，并且已經成功的發(fā)現了一些腫瘤抑制基因，這些基因的抑制會導致腫瘤增殖能力的增高以及相關支持物的增長。兩個類似的研究從shRNA文庫中篩選出一些基因，研究人員發(fā)現，這些基因能夠在人類腫瘤細胞系（結腸癌細胞系DLD-1和HCT116，乳腺癌細胞系HGC1954、MCF-10A、MDA-MB-435、MDA-MB-231、ZR-75.1和T47D）和正常乳腺上皮細胞中促進細胞增殖，不僅如此，有一些基因亞型也是生長和增殖所必須的。上述結果均表明這些基因很有可能成為新型抗癌治療靶點[27]。為了研究酪氨酸激酶（tyrosine kinases, TKs）對細胞生長的抑制作用，研究人員在乳腺癌細胞系中利用酪氨酸激酶特異性的siRNA構建了一個siRNA文庫，結果表明：TKs以及大約90余種蛋白在乳腺細胞信號轉導通路中發(fā)揮重要的作用，包括細胞的增殖，凋亡，分化及細胞的運動能力等[28]。

4.2 逆轉腫瘤耐藥研究中的應用 目前，治療惡性腫瘤的主要手段包括化學治療及放射治療，而影響化療效果的一個重要原因是腫瘤細胞產生了對化療藥物的耐藥性。腫瘤細胞的耐藥性，尤其是多藥耐藥問題，是目前的研究重點之一。Lai等[29]在哺乳細胞中利用能改變復雜細胞表型的siRNA構建了一個隨機siRNA文庫，在結直腸癌細胞中發(fā)現了一系列siRNA編碼的基因，這些基因能在氟尿嘧啶或腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TGF）-α介導的細胞死亡機制中，逆轉腫瘤細胞的耐藥性。他莫昔芬可以阻斷乳腺癌雌激素受體α（estrogen receptor α, Erα）信號傳導通路，是治療乳腺癌最常用的藥物之一，但由于耐藥性的出現，限制了它的應用。Iorns等[30]采用針對779個激酶和相關蛋白的RNAi文庫，發(fā)現依賴磷酸肌醇激酶1（phosphoinositide kinase 1, PDK1）信號通路對于多個ERα拮抗劑均有很強的敏感性，這為發(fā)現他莫昔芬治療的新靶點，進一步探索乳腺癌細胞的耐藥性提供了新的方向。紫杉醇是臨床上常用的治療腫瘤的化療藥物，然而，乳腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌等腫瘤常常對紫杉醇產生耐藥。Xu等[31]建立了針對人類基因組的慢病毒siRNA文庫，他們發(fā)現：septin10（SEPT10）的表達水平與人類對紫杉醇的敏感性正相關，這預示著SEPT10很有可能成為紫杉醇耐藥相關的生物標志物，這對于開辟基因治療和化學治療的新方法有重大的作用。

4.3 探索腫瘤遷移及轉移研究中的應用 目前，腫瘤遷移、轉移已成為當前腫瘤治療中亟待解決的重要問題，近年來研究人員通過對腫瘤遷移、轉移分子機制的深入研究和了解，已為腫瘤的治療和防治提供了新思路和新靶點。為了研究局部粘著斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）與細胞增殖、粘附、遷移的關系，Tsutsumi等[32]構建了由質粒表達的shRNA文庫，在Hela和HT1080細胞中挑選出能抑制FAK表達的克隆。他們發(fā)現：FAK蛋白表達下調能夠抑制細胞的粘附、遷移和增殖能力，在腫瘤形成和生長過程中起著重要的作用。為了探索CICP1基因在腫瘤轉移中發(fā)揮的作用，Nagai等[33]構建了穩(wěn)定的肺癌轉移細胞系——LNM 35的RNAi克隆，實驗結果表明：CICP1及其配體SEMA4B在體外能夠顯著抑制細胞的運動能力，在體內可以抑制肺癌細胞的轉移能力。這預示著CICP1及其配體SEMA4B將有可能在未來成為抑制肺癌轉移的分子治療靶點。

4.4 指導腫瘤診斷和治療中的應用 近年來，腫瘤的診斷、治療均取得了顯著的進步，這反映了腫瘤研究領域取得的卓越成績。腫瘤病研究的最終目的就是解決腫瘤診斷和治療中的難題。而RNAi文庫可以針對基因起作用，為其可應用于腫瘤的診斷和治療提供了機會。Bjorkman等[34]利用基于細胞芯片的siRNA文庫，解釋了腫瘤中已知的和新近發(fā)現的表觀遺傳學酶的作用，極大地促進了腫瘤表觀遺傳學的研究，在未來將有可能用于腫瘤的診斷和治療。為了探究急性髓性白血病的治療的新策略，Zuber等[35]利用一個針對已知染色質調定點的shRNA文庫，發(fā)現溴區(qū)包含蛋白4（bromodomaincontaining 4, Brd4）對于維持腫瘤的穩(wěn)定性具有重要作用，無論在體內或體外抑制Brd4的表達都能產生抗白血病的效應。這些結果表明：抑制Brd4的表達很有可能成為急性髓性白血病治療的方法之一。為了探索腫瘤藥物的聯合治療策略，Liu-Sullivan等[36]在四種肺癌細胞系中采用一個針對不同腫瘤基因的混合shRNA文庫，尋找抑制polo-like kinase（PLK1）聯合作用的靶點。他們發(fā)現：維甲酸類藥物確實能夠提高藥物敏感性并增強PLK1的抑制作用，進而阻止有絲分裂，導致細胞凋亡。這些結果表明：維甲酸可用來增強PLK1抑制劑——GSK461364的作用，并進一步說明RNAi文庫能成為證實聯合靶向治療的有效工具。尤其令人興奮的是，近期研究結果表明，RNAi文庫技術甚至可可用于腫瘤的分子治療中，進行特異的基因沉默并抑制腫瘤的生長[37]。

5 展望

各種文庫的迅速發(fā)展促使研究者不斷致力于RNAi的研究，而RNAi技術以及RNAi文庫應用的日趨成熟，為人類的各種重大疾病尤其是腫瘤疾病的治療提供了堅實的理論基礎。但RNAi存在的非特異性效應阻礙了RNAi文庫的進一步臨床應用，主要包括脫靶效應和免疫副反應。RNAi過程中可能伴隨的脫靶沉默效應，主要是因為直接導入細胞或胞內由dsRNA分解的siRNA與胞內其它非靶正?；虼嬖诓糠中蛄型葱?。而免疫副作用主要是激活天然免疫系統(tǒng)，誘導炎癥因子的產生，引起細胞的生長抑制等毒性作用。由脫靶效應產生的意外的基因調控和免疫副反應極大地限制著RNAi文庫技術的體內應用，成為其應用的一個主要障礙。如何既避免siRNA對機體免疫系統(tǒng)的脫靶副作用又保持siRNA的特異性靶基因沉默作用，成為siRNA設計的關鍵。如何構建使已知基因沉默效率較高的，帶有較少脫靶效應的，在體內和體外同時具備高通量篩選能力的新型RNAi文庫，是研究者需要進一步解決的問題。如何將RNAi文庫技術應用于體內研究進而進一步應用于臨床，怎樣應用于腫瘤病人的個體化治療，是研究人員和腫瘤科醫(yī)生共同探索的方向。盡管存在一系列理論和技術上的難題，我們仍堅信，隨著RNAi技術以及RNAi文庫的不斷發(fā)展，一定能在腫瘤研究領域開拓廣闊的應用前景。