王庭亮 綜述 祝 聯(lián) 審校

真皮間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展

王庭亮 綜述 祝 聯(lián) 審校

骨組織工程技術(shù)修復(fù)骨組織的缺損顯示了廣闊的應(yīng)用前景。真皮間充質(zhì)干細(xì)胞 （Dermal mesenchymal stem cells，DMSCs）來源于皮膚組織，易大量獲取，對供區(qū)損傷極小，具有包括成骨分化在內(nèi)的多向分化潛能，有望成為骨組織工程研究合適的種子細(xì)胞。我們就真皮間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

真皮間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化 骨組織工程

因創(chuàng)傷、腫瘤或疾病等各種原因造成的骨缺損，目前一般通過自體骨移植或同種異體骨移植的方法進(jìn)行修復(fù)。但是，自體骨移植對供區(qū)損傷大，采骨量有限，難以修復(fù)大塊的骨缺損；同種異體骨來源于骨組織庫，骨組織庫是按一定標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)選擇供體，收集、加工、滅菌、檢驗(yàn)、貯存和發(fā)放骨組織的機(jī)構(gòu)[1]。骨庫來源骨在治療骨缺損中的療效已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，但是異體骨的來源無法得到保障，難以應(yīng)對日益加劇的臨床需求。

骨組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損已經(jīng)顯示了廣闊的應(yīng)用前景。目前的骨組織工程研究多以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）作為種子細(xì)胞。BMSCs分化能力強(qiáng)，成骨效果確切，但是骨髓組織獲取的量較少，對供者損傷較大。ADSCs同樣具有成骨潛能，可以通過吸脂手術(shù)大量獲得，但獲得的細(xì)胞群體組成復(fù)雜，分離純化難度較大，且個體差異很大。

真皮間充質(zhì)干細(xì)胞（Dermal mesenchymal stem cells，DMSCs）來源于皮膚組織，易大量獲取，對供體損傷極小。研究表明，DMSCs具有包括成骨分化在內(nèi)的多向分化潛能[2-5]，有望成為骨組織工程研究合適的種子細(xì)胞。

DMSCs曾被認(rèn)為是有多向分化潛能的真皮成纖維細(xì)胞亞群[4-7]。但其特性符合國際細(xì)胞治療協(xié)會推薦的間充質(zhì)干細(xì)胞界定標(biāo)準(zhǔn)，所以將其命名為DMSCs[2，8-9]。

1 真皮間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征

1.1 真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

Toma等[10]于2001年首次從小鼠真皮中分離得到一種細(xì)胞，將其命名為皮膚前體細(xì)胞 （Skin-derived precursors，SKPs）。SKPs與Pittenger等[11]描述的成體間充質(zhì)干細(xì)胞（Adult mesenchymal stem cells，MSCs）特性截然不同，是一種能向神經(jīng)細(xì)胞和中胚層分化的多能非間充質(zhì)干細(xì)胞。Kawase等[12]重復(fù)并驗(yàn)證了Toma等的工作，并進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）能促進(jìn)SKPs的生長，但是TGF-β對神經(jīng)干細(xì)胞并沒有促進(jìn)生長的作用，表明SKPs與神經(jīng)干細(xì)胞并不相同。Toma等[13]于2005年證實(shí)，在人真皮中同樣存在SKPs。這些研究提示了真皮中可能含有復(fù)雜的成體干細(xì)胞群體。

Bartsch等[2]于 2005年，首次對DMSCs的增殖、體外擴(kuò)增、多向分化能力進(jìn)行了詳細(xì)的研究。證實(shí)DMSCs具有分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞的潛能，并根據(jù) DMSCs單細(xì)胞克隆均保留三向分化潛能，認(rèn)為DMSCs是由單一細(xì)胞系組成。陳付國等[5]對DMSCs分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的三向分化能力進(jìn)行了闡述，并進(jìn)行單細(xì)胞克隆研究，發(fā)現(xiàn)有單向分化、雙向分化和三向分化等不同水平分化潛能細(xì)胞存在，認(rèn)為DMSCs可能是復(fù)雜的干細(xì)胞群體。

1.2 DMSCs干細(xì)胞特征鑒定

1.2.1 DMSCs的自我更新能力

自我更新能力是鑒定干細(xì)胞的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。干細(xì)胞通過不對稱分裂產(chǎn)生子代干細(xì)胞和非干細(xì)胞成分，子代干細(xì)胞維持其復(fù)制能力，非干細(xì)胞成分則繼續(xù)分化。研究發(fā)現(xiàn)，DMSCs經(jīng)100次以上倍增，仍能保留染色體的完整性和多向分化潛能[2]。陳付國等[5]的實(shí)驗(yàn)顯示，體外傳代至15代的DMSCs的擴(kuò)增能力未見減弱，到達(dá)對數(shù)倍增期的時間也無顯著改變。另一項(xiàng)對比研究提示，DMSCs的倍增時間短于BMSCs和ADSCs[14]。

1.2.2 DMSCs的多向分化潛能

DMSCs具有向中胚層三大分化方向（骨、脂肪、軟骨）分化的能力。通過單細(xì)胞克隆誘導(dǎo)分化，Bartsch等[2]發(fā)現(xiàn)單克隆的細(xì)胞系均有三向分化能力；陳付國等[4]則發(fā)現(xiàn)有單向分化、雙向分化及三向分化等不同水平分化潛能細(xì)胞存在，認(rèn)為Bartsch等獲得的單一細(xì)胞系只是細(xì)胞群中的一種。但是，Pittenger等[11]在BMSCs誘導(dǎo)分化過程中發(fā)現(xiàn)，部分克隆表現(xiàn)出有限的分化能力時，克隆細(xì)胞的分裂增殖次數(shù)增加，體外培養(yǎng)環(huán)境等因素均可能導(dǎo)致這些細(xì)胞本來存在的多向分化潛能的丟失。Manini等[15]亦觀察到ADSCs在培養(yǎng)過程中，容易丟失成脂分化能力，但仍保留成骨分化能力，這在某種意義上證實(shí)了Pittenger等的推測。由此可以認(rèn)為，陳付國等發(fā)現(xiàn)有不同分化水平的間充質(zhì)干細(xì)胞存在，可能只是培養(yǎng)過程中分化潛能丟失的表現(xiàn)。因此，DMSCs是單一細(xì)胞系還是多細(xì)胞系，尚需進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

1.2.3 DMSCs表面標(biāo)志物

Bartsch等[2]對DMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞分析顯示，DMSCs表達(dá)CD90和 CD105，同時表達(dá)中胚層細(xì)胞標(biāo)志 SSEA-4。SSEA-4是一種胚胎早期的糖酯抗原，通常作為未分化的多能胚胎干細(xì)胞和囊胚期卵裂胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，可用于鑒定篩選BMSCs[16]，但是用于DMSCs的篩選尚未見報(bào)道。陳付國等[4]研究顯示，DMSCs表達(dá)的表面標(biāo)志有 CD13、CD29、CD49d、CD105和Stro-1等；低或不表達(dá)CD34、CD45、CD106和CD133等。Lorenz等[6]的實(shí)驗(yàn)顯示，陽性表達(dá)CD44、CD71、CD73、CD90、CD105和CD166；CD14、CD31、CD34、CD45和CD133為陰性。Orciani等[17]的結(jié)果表明，HLA-A、B、C和CD29、CD44、CD73以及CD90為強(qiáng)陽性，CD105為弱陽性，CD10、CD11b、CD14、CD34、CD49d和HLA-DR為陰性。其中CD34和CD45是造血細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物。上述結(jié)果均表明，DMSCs不表達(dá)CD34和CD45，提示了DMSCs與造血系細(xì)胞的不同；而CD44、CD73、CD90和CD105是間充質(zhì)干細(xì)胞相對特異性的表面標(biāo)志物，均在上述一系列實(shí)驗(yàn)中呈現(xiàn)陽性表達(dá)。然而，目前的研究尚未發(fā)現(xiàn)DMSCs特異性的表面標(biāo)志物。值得注意的是，上面的結(jié)果與ADSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)非常相似[18]。

2 真皮間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

2.1 DMSCs成骨亞群的分離與純化

從皮膚組織中獲得的DMSCs混雜有大量的其他細(xì)胞，另外DMSCs本身也可能是不同分化潛能細(xì)胞組成的群體。因此，分離與純化DMSCs具有重要的實(shí)際應(yīng)用價值。陳付國等[5]最早對DMSCs的分離純化進(jìn)行了探索，但實(shí)驗(yàn)顯示，CD105+細(xì)胞并未表現(xiàn)出明顯的增殖和分化優(yōu)勢。此后，有研究嘗試對不同分化潛能的DMSCs進(jìn)行差異膜蛋白分析，試圖找到合適的表面標(biāo)志物以分離具有不同潛能的DMSCs，但未獲得期待的結(jié)果[19]。通過研究其他表面標(biāo)志物，如CD13、CD44、CD54、CD271等，試圖對DMSCs進(jìn)行分離純化也未獲成功[7，17，20]。He等[14]利用細(xì)胞表面骨形成蛋白 I型受體 B亞型（Bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）對DMSCs進(jìn)行分離純化，得到BMPRIB+和BMPRIB-兩群細(xì)胞，結(jié)果顯示前者的增殖和成骨分化潛能明顯優(yōu)于后者，且前者成骨分化能力與BMSCs相近,表明BMPR-IB可能就是特異性的表面標(biāo)志物。相關(guān)研究已對BMPR-IB在成骨分化中的作用進(jìn)行了初步探討[21]，但是其機(jī)制還需更深入的研究。

2.2 DMSCs成骨分化誘導(dǎo)

2.2.1 生物化學(xué)誘導(dǎo)因素

研究顯示，DMSCs同其他成體間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，不能夠自行分化為骨細(xì)胞，需要外源性誘導(dǎo)分化介質(zhì)[2，5]。體外成骨誘導(dǎo)介質(zhì)主要由地塞米松、β磷酸甘油、維生素C組成。地塞米松能增加堿性磷酸酶（ALP）活性和BMP-6基因表達(dá)，但持續(xù)存在的這些分化促進(jìn)劑能夠誘導(dǎo)一些間充質(zhì)干細(xì)胞群體的凋亡[22]；皮質(zhì)類固醇激素在體內(nèi)能造成骨質(zhì)疏松等不利于成骨的影響。因此，成骨誘導(dǎo)介質(zhì)的改進(jìn)一直是研究的熱點(diǎn)。Hee等[23]發(fā)現(xiàn)，1α,25-二羥維生素D3是強(qiáng)有力的誘導(dǎo)成骨分化劑，在DMSCs誘導(dǎo)成骨分化中，維生素D3誘導(dǎo)組產(chǎn)生的ALP活性高于地塞米松組，也高于這兩者共同誘導(dǎo)組，但是在BMSCs中，必須存在地塞米松才能誘導(dǎo)成骨分化。Chevallier等[22]的研究表明，血小板溶解物培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞（不添加其他成骨誘導(dǎo)介質(zhì)）在體外能夠自發(fā)地誘導(dǎo)成骨基因（如ALP、BSP、OP、BMP-2）的表達(dá)，加強(qiáng)成骨分化，并且種植于陶瓷支架上能夠在體內(nèi)異位成骨。

2.2.2 物理機(jī)械誘導(dǎo)因素

物理機(jī)械因素對體內(nèi)骨的形成、保持和更新均有重大影響。Sommar等[24]證實(shí)，體外流體剪切力有一定的獨(dú)立成骨誘導(dǎo)能力，能夠加強(qiáng)DMSCs的成骨分化。Pre等[25]發(fā)現(xiàn)，低振幅的高頻振動可加強(qiáng)ADSCs的成骨分化，并縮短成骨分化時間，并可在無成骨誘導(dǎo)介質(zhì)時單獨(dú)誘導(dǎo)成骨分化。Delaine-Smith等[26]認(rèn)為，調(diào)控體內(nèi)骨的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度的機(jī)械力量主要是振蕩的流體剪切力，他們將化學(xué)成骨誘導(dǎo)介質(zhì)和振蕩的流體剪切力兩者結(jié)合，觀察對DMSCs成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)I型膠原分泌增加，膠原結(jié)構(gòu)改變，ALP活性增強(qiáng)，礦物質(zhì)沉積增加等現(xiàn)象。以上研究表明，物理機(jī)械因素可能是通過影響細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)（如膠原結(jié)構(gòu)）的途徑產(chǎn)生某些信號分子或激活某些信號通路，增強(qiáng)其成骨分化能力。

2.2.3 細(xì)胞間相互作用

血管生成與成骨是密切相關(guān)的，微血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞的相互作用在骨再生過程中極為重要。Laranjeira等[27]將微血管內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞按4∶1的比例共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，ALP、Ⅰ型膠原、RUNX2基因表達(dá)和細(xì)胞外礦物質(zhì)沉積均明顯優(yōu)于單純的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，增強(qiáng)了成骨分化；同時，內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成基因表達(dá)也增強(qiáng)了。細(xì)胞共培養(yǎng)體系模擬體內(nèi)細(xì)胞相互作用過程，對骨組織工程體外構(gòu)建有重要意義，同時有利于保持細(xì)胞增殖和分化潛能。

2.3 DMSCs構(gòu)建骨組織的研究進(jìn)展

目前，DMSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建骨組織已有了良好的進(jìn)展。Kang等[9]將豬DMSCs在去礦物質(zhì)骨和纖維蛋白凝膠支架上共培養(yǎng)，結(jié)果表明，去礦物質(zhì)骨和纖維蛋白凝膠支架復(fù)合DMSCs能進(jìn)行自體骨移植。Sommar等[24]在體外將人DMSCs置于三維大孔徑明膠微載體中培養(yǎng)，并使用流體剪切力進(jìn)行誘導(dǎo)，顯示出良好的成骨潛能。

3DMSCs與BMSCs、ADSCs成骨分化能力的比較

何金光等[28]通過對人DMSCs、BMSCs、ADSCs的對比研究發(fā)現(xiàn)，在定量條件下，DMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力要弱于ADSCs和BMSCs,認(rèn)為未經(jīng)分離純化的DMSCs并不適合作為骨組織工程的種子細(xì)胞。但是，通過BMPR-IB分離和純化得到的BMPRIB+細(xì)胞群成骨分化能力與BMSCs相近，表現(xiàn)出作為骨組織工程種子細(xì)胞的可能性。

4 應(yīng)用前景

采用組織工程技術(shù)構(gòu)建骨組織，進(jìn)行用于骨缺損的修復(fù)，合適的種子細(xì)胞是研究的重點(diǎn)。有研究顯示，DMSCs在體外不刺激T細(xì)胞增殖，在體內(nèi)不引起免疫排斥反應(yīng)[29-32]。雖然DMSCs的臨床應(yīng)用還有很多亟待解決的問題，但是作為一種新的種子細(xì)胞，DMSCs在骨組織工程乃至整個再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可能擁有廣闊的研究及應(yīng)用前景。

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Osteogenic Differentiation of Dermal Mesenchymal Stem Cells

WANG Tingliang,ZHU Lian.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHU Lian(zhulian6@hotmail.com).

Dermal mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Bone tissue engineering

Q813.1+2

B

1673－0364（2013）01－0047－04

2012年10月20日；

2012年11月29日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.01.015

200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

祝聯(lián)（E-mail：zhulian6@hotmail.com）。

【Summary】Tissue engineered bone showed broad prospects in bone transplantation.Dermal mesenchymal stem cells derived from skin tissue are easy to obtain large volumes,have minimal damages to the donor,have the ability of multipotential differentiation including osteogenic differentiation,and are expected to become the most appropriate seed cells in bone tissue engineering.In this paper,the research progress of osteogenic differentiation in dermal bone mesenchymal stem cells is reviewed.