李慶偉 張 聰 綜述 孟純陽 審校

·綜述·

氧預(yù)處理的BMSCs聯(lián)合支架材料修復(fù)骨缺損的研究進(jìn)展

李慶偉 張 聰 綜述 孟純陽 審校

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定的條件下可以分化為具有特定功能的細(xì)胞系，作為種子細(xì)胞參與骨缺損的修復(fù)，顯示了良好的應(yīng)用前景。氧預(yù)處理是種子細(xì)胞在種植到支架材料前，為改善細(xì)胞生存和適應(yīng)能力所采取的措施，旨在減少或防止種子細(xì)胞丟失。本文就經(jīng)過氧預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合支架材料修復(fù)骨缺損的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

骨缺損 預(yù)處理 高壓氧 支架材料

組織工程技術(shù)在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域已得到廣泛的關(guān)注，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）作為種子細(xì)胞參與骨缺損的修復(fù)，顯示了良好的應(yīng)用前景。大量研究表明，不同的細(xì)胞微環(huán)境對BMSCs的增殖、分化會產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響修復(fù)的效果。低氧濃度對BMSC的增殖有明顯的促進(jìn)作用，但對于分化作用仍存在分歧。另外，用于骨缺損修復(fù)的生物材料種類繁多，不同的材料對治療效果也有非常重要的影響。本文就不同氧濃度處理BMSC聯(lián)合支架材料，經(jīng)高壓氧修復(fù)骨缺損的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 BMSC的來源、功能和成骨調(diào)節(jié)機(jī)制

BMSC是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的一種干細(xì)胞，在骨髓組織中最為豐富。研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞可以在不同條件下分化為所有中胚層來源的組織，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，已成為最具潛力的骨組織工程種子細(xì)胞[1]。

體外培養(yǎng)時，BMSC需要依賴成骨誘導(dǎo)作用才能向成骨方向分化。刺激MSCs成骨細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子有很多。包括①骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenesis protein 2，BMP-2），被認(rèn)為是使間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的最初信號分子，是一組低分子量肽類物質(zhì)，通過BMP-2受體、靶基因和信號途徑，組成完整的信號系統(tǒng)發(fā)揮骨誘導(dǎo)作用。BMP-2處于系統(tǒng)的核心和啟動位點(diǎn)[2]。BMP是強(qiáng)有力的誘導(dǎo)因子之一，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，新骨的形成量與BMP的表達(dá)量呈正相關(guān)[3]。②成纖維細(xì)胞生長因子（FGF），在BMSC增殖中有著重要作用。③地塞米松 （DXM），作為糖皮質(zhì)激素可以促進(jìn)其成骨細(xì)胞分化。早期以促進(jìn)基質(zhì)合成為主，晚期以促進(jìn)礦化為主。④轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），可增強(qiáng)細(xì)胞分裂、增殖，促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生，同時還具有抑制干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的作用。除此之外，β-甘油磷酸鈉（β-GP）、維生素 C（VitC）等也能促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化。但是上述生長因子成本高昂，整個分離、培養(yǎng)過程技術(shù)較為復(fù)雜，離真正的臨床應(yīng)用還有較大距離。今后應(yīng)在生長因子的替代研究和培養(yǎng)技術(shù)的簡便化方面進(jìn)行更為深入的研究，使之能夠真正地應(yīng)用于臨床患者。

2 不同氧濃度處理對BMSC增殖、分化的影響

BMSC作為骨組織工程的種子細(xì)胞，高效獲取、大量擴(kuò)增等仍然是亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞體外增殖分化通常是在20%氧的條件下，而體內(nèi)動脈血氧濃度約12%，組織的平均氧濃度約3%，骨髓的氧濃度為l%～7%，富集干細(xì)胞的胚體氧濃度更低，而且處于一種動態(tài)變化中。Bosch等[4]分離培養(yǎng)豬來源的MSCs，發(fā)現(xiàn)其在低氧條件下增殖能力增強(qiáng)。大量文獻(xiàn)顯示，低氧促進(jìn)MSCs擴(kuò)增并抑制分化[5-7]。

研究顯示，低氧環(huán)境有利于MSCs的增殖。D'Ippolito等[8]將成體骨髓多向誘導(dǎo)細(xì)胞（Marrow-isolated adult multilineage inducible，MIAMI）置于不同氧濃度（1%，3%，5%，10%，21%）的環(huán)境中培養(yǎng)擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在3%氧濃度下培養(yǎng)3 d的細(xì)胞總數(shù)，比在21%氧濃度下培養(yǎng)7 d的還要多3倍，據(jù)此推測，低氧微環(huán)境有利于促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的自我更新和增殖。其他研究也發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境能夠促進(jìn)MSCs集落增殖，同樣復(fù)氧過程對MSCs增殖的抑制作用也證實(shí)了這一點(diǎn)[9-10]。Lennon等[7]研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境可以使鼠MSCs成骨能力增強(qiáng)。這些差異可能跟細(xì)胞的來源有關(guān)，用于研究的MSCs包括鼠源或人源，骨髓來源或脂肪來源等，不同來源的細(xì)胞對氧的適應(yīng)能力可能存在差異[11]。 Moussavi等[12]研究表明，MSCs在體內(nèi)處于低氧環(huán)境中，因而對高氧應(yīng)激敏感，在2l%氧濃度下培養(yǎng)的細(xì)胞比5%氧濃度下培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生更多的氧化產(chǎn)物，對生長不利。

高濃度的乳酸可影響細(xì)胞的代謝，抑制MSCs生長[13]。因此，低氧條件下大規(guī)模擴(kuò)增MSCs時，應(yīng)注意培養(yǎng)液中乳酸的濃度，防止高濃度乳酸對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用。

不同氧濃度對BMSC分化的影響，目前尚存在爭議。在同樣的成骨誘導(dǎo)過程中，5%氧濃度下MSCs產(chǎn)生的礦化物質(zhì)與在20%氧濃度中產(chǎn)生的相比，少了近50%；當(dāng)將在5%氧濃度中的MSCs轉(zhuǎn)移至20%氧濃度中誘導(dǎo)分化時，礦化物質(zhì)的產(chǎn)生量達(dá)到了20%氧濃度組的水平[14]。Fehrer等[9]將MSCs置于不同氧濃度中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，運(yùn)用qPCR分析MSCs向脂肪細(xì)胞或成骨細(xì)胞的分化情況，結(jié)果顯示，低氧濃度中的MSCs向脂肪細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化的能力明顯減弱。D'Ippolito等[8]同樣檢測到高氧組中成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)要明顯高于低氧組。暴露于低氧環(huán)境中時間的長短，都將成為MSCs成骨分化的影響因素。

大量研究表明，氧濃度微環(huán)境對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化都具有重要的調(diào)節(jié)作用，但由于細(xì)胞來源、誘導(dǎo)方向、誘導(dǎo)條件等多種不確定因素，氧濃度對MSCs分化的影響尚缺乏定論，有待于進(jìn)一步的探討和研究。

3 支架材料的研究

在骨組織工程的研究中，支架材料的選擇也是相當(dāng)重要的環(huán)節(jié)，不僅影響著新骨的形成，而且關(guān)系到骨缺損處承受負(fù)荷的能力[15]。

3.1 羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）

HA是人類骨組織中主要的無機(jī)礦物質(zhì)，本身并不具有成骨能力，在骨形成過程中起中心支架作用。但存在脆性較大、較難切割等缺點(diǎn)[16]。

3.2 納米羥基磷灰石（nano-HA）

nano-HA更好地模擬了天然的骨組織結(jié)構(gòu)，支持植入細(xì)胞的黏附、增殖和分化，可有效促進(jìn)新骨形成[17]。Zhu等[18]用孔徑為50~150 μm、100~250 μm和300~500 μm的nano-HA參與兔骨缺損的修復(fù)，發(fā)現(xiàn)孔隙范圍在100~250 μm之間的nano-HA材料對成骨更有利，是較為理想的支架材料。但是，Vaz等[19]認(rèn)為500 μm微孔直徑的nano-HA更合適骨細(xì)胞生長。

3.3 高分子聚合物

高分子聚合材料，包括多聚乳酸（PLA）、多聚羥基乙酸（PGA）、聚乳酸和聚羥基乙酸共聚物（PLGA）等，這類材料延展性好，可塑形，易降解，常用于關(guān)節(jié)軟骨構(gòu)建[20]。但聚合材料存在著細(xì)胞吸附力弱，材料降解時間不易控制等缺點(diǎn)。

3.4 復(fù)合材料

研究發(fā)現(xiàn)，如果將HA與高分子聚合物相融合所產(chǎn)生的復(fù)合物的力學(xué)性能將大為提升，克服了HA本身易碎的缺點(diǎn)，膠原-HA-PLGA、PEG、殼聚糖-HA、膠原-PLA-HA及PLC-HA等復(fù)合材料的實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了這一點(diǎn)[21]。Hu等[22]認(rèn)為，膠原/納米羥基磷灰石（nano—HA/CO）具有良好的生物降解性，內(nèi)部孔隙率達(dá)到84%，更接近于正常骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)，利于成骨細(xì)胞的增殖分化以及新生血管的進(jìn)入。而Teng等[23]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖/n-HA復(fù)合物中兩種物質(zhì)具有良好的可混合性，當(dāng)n-HA達(dá)到總量30%時，細(xì)胞堿性磷酸酶水平最高，但隨著n-HA含量的增加，整個復(fù)合物的穩(wěn)定性會有所下降。Isikli等[24]對殼聚糖-明膠/HA復(fù)合物進(jìn)行抗壓試驗(yàn)，得出彈性模數(shù)值和人的松質(zhì)骨相近，細(xì)胞在該種材料上的黏附和增殖比在其他材料中要好。Xu等[25]把孔隙大小在300~500 μm的n-HA/PA66作為支架材料，認(rèn)為更利于細(xì)胞的增殖和血管形成，盡管孔洞結(jié)構(gòu)會造成復(fù)合材料的穩(wěn)定性不夠，但隨著新生組織的爬行生長，會逐步改善材料的承重能力。

目前，對于復(fù)合材料的研究雖然取得了較大進(jìn)展，但仍存在一定問題。各種材料在生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度、降解速率、免疫原性等一系列指標(biāo)上，能否達(dá)到理想水平，尚需要進(jìn)一步的探索。

4 高壓氧在BMSC聯(lián)合支架材料修復(fù)骨缺損中的應(yīng)用

研究表明，短期缺氧可促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長，但長期缺氧可抑制成骨細(xì)胞的生長、分化和骨形成能力。因此，隨著缺氧時間的延長，成骨細(xì)胞的增殖能力開始下降[26]。高壓氧用于延遲骨愈合、骨不連、放射性骨髓炎等疾病的治療取得了顯著的效果，是促進(jìn)骨生長的重要因素。研究表明，高壓氧（HBO）在治療過程中，通過增加局部組織的氧分壓，進(jìn)而增加了膠原的合成和新生血管的形成，最終刺激新骨形成[27]。最新研究顯示，高壓氧處理有利于MSCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)活體椎骨椎間骨融合[28]。 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)生理性或病理性的氧分壓降低可引起骨量的丟失，但具體機(jī)制不明[29]。

如果先使BMSCs附著于載體，通過處理，細(xì)胞不但不會消失，而且可以形成新的骨組織，提高成骨能力。因此，選用適宜的細(xì)胞外基質(zhì)作為載體，能夠?yàn)榧?xì)胞提供黏附及生長繁殖的空間，有利于組織再生。合適的載體系統(tǒng)是將MSCs運(yùn)用到臨床修復(fù)骨缺損的重要前提之一。研究結(jié)果表明，HBO并不干擾HA的骨再生作用，相反，HBO促進(jìn)了新骨形成速度，提高了新骨的鈣化程度[30]。另外，HBO能促進(jìn)HA種植體在游離植骨上形成骨整合，有利于骨組織間的結(jié)合與骨的爬行替代[31]。

5 總結(jié)和展望

如果能夠通過氧濃度因素實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞分化、定向誘導(dǎo)的調(diào)控，可以避免化學(xué)因素對人體的危害，為干細(xì)胞分化、定向誘導(dǎo)開辟一條新途徑，預(yù)防和治療骨丟失，成為骨缺損修復(fù)的新方法。

BMSC構(gòu)建組織工程化骨，用于骨缺損的修復(fù)，已在實(shí)驗(yàn)研究中取得了巨大的成就，也在臨床應(yīng)用研究中獲得了一定的進(jìn)展，但大規(guī)模的臨床應(yīng)用尚存在著諸多亟待解決的問題。隨著組織工程學(xué)研究和相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，骨組織工程技術(shù)修復(fù)骨缺損將成為全新的革命性的方法，并最終改變現(xiàn)有的治療模式。

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BMSCs of Oxygen Preconditioning Combining Scaffold Materials in the Reconstruction of Bone Defects

LI Qingwei,ZHANG Cong,MENG Chunyang.Department of Orthopedics,Jining Medical College Affiliated Hospital,Shandong 272029,China.Corresponding author:MENG Chunyang(E-mail:plasurg0618@163.com).

Bone defect; Preconditioning; Hyperbaric oxygen; Scaffold materials

Q813.1+2

B

1673－0364（2013）01－0044－03

2012年10月28日；

2012年12月21日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.01.014

山東省自然科學(xué)基金（ZR2010HM090）；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院青年基金（2012056）。

272029 山東省濟(jì)寧市 山東濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱外科。

孟純陽（E-mail：plasurg0618@163.com）。

【Summary】Bone mesenchymal stem cells (BMSC)are adult stem cells and can be differentiated into specific cell lines under certain conditions.BMSC as seed cells have showed good prospect in the reconstruction of bone defects.Oxygen Precondition with subsequent stress is carried out before planting scaffold materials to improve the cell survival and adaptation,so as to reduce or prevent the loss of seed cells.In this paper,the effects of BMSC after oxygen preconditioning combining scaffold materials in the reconstruction of bone defects were reviewed.