羅 勇 ,駱海萍 ,覃邦余 ,劉廣立 *,張仁鐸

(1.江西省環(huán)境監(jiān)測中心站,江西 南昌 330077；2.中山大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510275；3.廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)技術(shù)重點實驗室,廣東 廣州 510275)

在海洋食物制品行業(yè)、印染行業(yè)、石油天然氣行業(yè)和飲用水處理等工業(yè)處理過程中,都會產(chǎn)生大量的高鹽度廢水(＞2%W/VNaCl)[1-2].處理高鹽度廢水主要有物理、化學(xué)和生物技術(shù),其中生物方法相對廉價且可以持續(xù)利用[3-5].然而,用生物方法處理高鹽度廢水時,高鹽度廢水會影響微生物的物理和生物化學(xué)性能,導(dǎo)致微生物細(xì)胞脫水,從而影響生物反應(yīng)器的處理性能[6-7].

近年來微生物燃料電池(MFC)在污水處理領(lǐng)域受到了國內(nèi)外廣泛的關(guān)注,尤其是其利用微生物為催化劑將廢水中的有機物轉(zhuǎn)化為電能的優(yōu)點更是格外引人關(guān)注[8].自從2004年美國賓州州立大學(xué)Logan小組首次將單室MFC用于處理生活污水并取得較好效果之后[9],此后,各種各樣的實際廢水被用于MFC中.目前,MFC已被證明能夠處理多種高濃度有機廢水[9-11],如養(yǎng)豬廢水、生活污水和糠醛廢水等.然而,用 MFC去處理高鹽度廢水時,廢水中的鹽分很可能通過影響陽極燃料的氧化,電子傳遞以及微生物群落,從而影響MFC的性能.因此,研究鹽度廢水對MFC性能影響同時分析鹽度影響MFC的過程是很有必要[12],然而,迄今鮮見相關(guān)報道.

本課題組使用運行超過3個月的雙室MFC研究不同鹽度對MFC產(chǎn)電性能的影響,同時調(diào)查MFC陽極微生物能否忍受高鹽度廢水以及鹽度的變化是否會導(dǎo)致陽極微生物群落改變.

1 材料和方法

1.1 試驗裝置和材料

實驗使用的三個MFC反應(yīng)器均由有機玻璃制成,其形態(tài)和結(jié)構(gòu)與之前報道的類似[8].陰極室和陽極室的體積均為 18mL,兩極之間采用質(zhì)子交換膜(Dupont,212)隔開.陰極采用50mmol/L鐵氰化鉀作為電子受體. 陽極材料和陰極材料均為碳毛刷纖維,其長寬分別為7 cm和3.6cm.外電路通過導(dǎo)線與插入陰陽極的碳纖維相連而構(gòu)成回路,外電阻是1000?.陽極液和陰極液可通過恒流泵(上海琪特分析儀器有限公司,BT12200)以流速為 20mL/min分別在陰陽室和陰陽極瓶(200mL棕色瓶)之間循環(huán)流動. MFC輸出電壓由DT85數(shù)據(jù)采集卡每隔30S采集一次.MFC始終保持在恒溫水浴鍋中[(30±1)℃].

1.2 MFC的接種與運行

本研究采用的3個MFC反應(yīng)器,分別標(biāo)記為 MFC-A、MFC-B和 MFC-C.從已穩(wěn)定運行半年的MFC中接種微生物到三個MFC陽極中.此后,加入1000mg/L葡萄糖作為陽極基質(zhì)運行所有 MFC,待所有 MFC獲得兩個穩(wěn)定的電壓輸出周期后.在 MFC-A陽極基質(zhì)中依次加入20,40,60,70g/LNaCl,在每個鹽度下運行至少 2個周期;在MFC-B中.在陽極基質(zhì)中加入40g/L NaCl,在此鹽度運行至少2個周期;在MFC-C中,在陽極基質(zhì)中直接加入 70g/L NaCl,同樣運行至少2個周期.

1.3 MFC陽極微生物的群落分析

MFC陽極微生物的群落分析過程如下,首先,使用FastDNA SPIN for Kit (MP BIO, IIIKirch,France)提取陽極電極上細(xì)菌的 DNA,并將提取后的 DNA 樣品放置在-20℃冰箱中保存.使用V3-2 (5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3)和V3-3(5-CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)(Invitrogen Biotechnology Co., Ltd.)兩種引物從已提取的 DNA上去擴增 16S ribosomal DNA(rDNA). PCR的擴增液主要包括：17.37L dd H2O,2.5L 10′PCR Buffer,2.0L DNTP mixture,0.5L V3-2,0.5L V3-3,0.13L Taq polymerase和2L樣品.

PCR產(chǎn)物的DGGE分析在變形梯度凝膠電泳中進(jìn)行,電泳液為20L左右的1×TAE,溫度設(shè)定為60℃.將點有PCR產(chǎn)物樣品的聚丙烯酰胺凝膠放入電泳槽內(nèi),在200mV電壓下電泳 6h.電泳結(jié)束后,將膠在濃度為 5μL EB/100mL 1×TAE的溶液避光染色20min,然后在紫外成像系統(tǒng)中拍照.

用手術(shù)刀把目的條帶從DGGE膠上切割下來,加入 20μL TE溶液,搗碎膠塊,在溫度為 50℃的水槽中,水浴 30min,然后以轉(zhuǎn)速為 12000r/min離心30s.取上清液5μL,用V3-1和V3-2為引物在25μL混合體系中進(jìn)行PCR擴增. PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司進(jìn)行測序.測序結(jié)果與 NCBI用BLAST進(jìn)行比對.

1.4 分析和計算方法

CODcr為標(biāo)準(zhǔn)分析方法[11].庫侖效率CE的計算如下[8]：

式中：M為氧氣的分子量,32g/mol;ti為時間;Ui為t時刻的電壓;b為每摩爾氧氣轉(zhuǎn)移的電子數(shù);V為反應(yīng)器容積;R為外電阻;F為法拉第常數(shù)96487C/mol;△S為COD的變化.

體積功率密度(PV, W/m3)計算如下：

2 結(jié)果

2.1 鹽度對MFC產(chǎn)電的限制

圖 1A為 MFC-A在不同鹽度下(0,20,40,60,70g/L NaCl)的11個產(chǎn)電周期.當(dāng)陽極基質(zhì)不含NaCl時,MFC的電壓迅速升高到 660mV,這表明在沒有NaCl的情況,陽極微生物能夠很快適應(yīng)葡萄糖并對外輸出電能;當(dāng)在陽極基質(zhì)中加入20g/L NaCl后,最大輸出電壓輕微下降,從 660mV 下降到615mV;然而,當(dāng)NaCl濃度從40g/L繼續(xù)升高,最大輸出電壓迅速下降,至70g/L NaCl時,最大輸出電壓僅有130mV(圖1A).在MFC-B中,當(dāng)向陽極基質(zhì)中直接加入40g/L NaCl后第一個周期,最大輸出電壓下降到 520mV,第二周期下降到300mV,此后,MFC沒有明顯的電能輸出(圖1B).在MFC-C中,當(dāng)直接向陽極基質(zhì)加入70g/L NaCl后第一個周期,最大電壓立刻下降到 260mV,此后,MFC沒有明顯的電能輸出(圖 1C).研究表明,NaCl可以明顯地限制MFC的產(chǎn)電,尤其是直接向陽極基質(zhì)加入40,70g/L NaCl時.

圖1 分別加入不同濃度NaCl時,MFC的產(chǎn)電情況Fig.1 Electricity voltage outputs of the MFC with the different salinity of NaCl

2.2 不同鹽度下MFC的功率密度和庫侖效率

圖 2為陽極基質(zhì)中 NaCl濃度為 0,40,70g/L時MFC-A的功率密度曲線.陽極基質(zhì)的NaCl濃度為 0時,MFC的最大功率密度為34W/m3;當(dāng)NaCl濃度為40g/L時,MFC的最大功率密度為 25W/m3;當(dāng) NaCl濃度提高到70g/L時,MFC 的最大功率密度為僅為1.4W/m3.NaCl的濃度也很明顯地影響 CE.從表1可知,NaCl的濃度為0時,MFC的CE高達(dá) 67%;當(dāng) NaCl的濃度從 0提高到 70g/L時,CE從67%下降到4%.

2.3 鹽度抑制后的MFC電能恢復(fù)

當(dāng)陽極基質(zhì)的 NaCl濃度為 70g/L時,MFC-A 無明顯的電能輸出.此時,停止添加NaCl以觀察MFC電能輸出是否會恢復(fù).從圖3可以看出,停止添加NaCl后的第一個周期,MFC的輸出電壓可以在50h內(nèi)緩慢地恢復(fù)到400mV,隨后下降到 50mV.更換新的基質(zhì)后,輸出電壓能夠在 10h內(nèi)迅速地升高到 630mV.結(jié)果表明,MFC產(chǎn)電性能即使受到高鹽度限制后也可以迅速地恢復(fù).

圖2 陽極基質(zhì)中NaCl濃度為0,40,70g/L時MFC-A的功率密度曲線Fig.2 Power density and cell voltage as a function of current density for the MFC-A with the salinity of 0, 40, and 70g/L NaCl

表1 MFC-A中CE與NaCl濃度的關(guān)系Table 1 The CEs as functions of the concentrations of NaCl in the MFC-A

2.4 鹽度變化下的陽極微生物情況分析

圖4是MFC-A在0g/L NaCl (A),40g/L NaCl(B),70g/L NaCl (C)以及再次不添加NaCl(D)時生物膜中主要細(xì)菌種類基因片段成像.圖 4中每條亮帶代表一個細(xì)菌種類,其亮度表示該細(xì)菌在微生物群落中的相對豐富度.當(dāng) NaCl濃度為 0(A)和 40g/L(B)時,Band 1和 Band 4明顯;然而,當(dāng)NaCl濃度為70g/L時(C), Band 1和Band 4消失.此后,不再添加NaCl(D),Band 4再次出現(xiàn)且較亮度較高,但Band 1未出現(xiàn),出現(xiàn)了Band 3,當(dāng)NaCl為70g/L時,此亮帶消失.幾乎所有鹽度下都存在Band 2,但70g/L時亮度最大.

圖3 MFC-A的電能輸出被70g/L NaCl限制后的恢復(fù)情況Fig.3 Electricity recovery process after the MFC-A was inhibited by 70g/L NaCl.

圖4 NaCl濃度分別為0 (A),40 (B),70 (C),0g/L (D)時MFC-A的陽極DGGE圖像Fig.4 PCR-DGGE analysis of 16S rDNA extracted from the anode of the MFC-A with a salinity of 0 (A), 40 (B),70 (C), and 0g/L NaCl (D)

對亮帶進(jìn)行 DNA序列測定后將結(jié)果與Blast進(jìn)行比對,結(jié)果見表2.Band 1與Uncultured Bacteroidetes bacterium clone A21YG08RM small subunit具有 96%的同源性;Band 2與 Uncultured soil bacterium clone F3-266 16S ribosomal RNA gene 具有97%的同源性;Band 3和Band 4分別與16S rDNA sequence homology with Enterobacter cloacae subsp. dissolvens strain SDM 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 和 Shewanella sp. JC19 partial 16S rRNA gene, strain JC19展示了100%的同源性.這4個DNA條帶的序列在Gene bank的登錄號分別從HQ657324到HQ657327.

表2 不同鹽度下MFC-A生物膜上細(xì)菌16S rDNA 基因片段特性Table 2 Characterization of isolated 16S rRNA gene fragments derived from the electrodes of the MFC-A with different salinities

3 討論

在以往的研究中,關(guān)于 NaCl濃度對廢水生物反應(yīng)器性能的影響存在一些爭議.有學(xué)者認(rèn)為,在生物反應(yīng)器加入少量的NaCl可以提高微生物的活性,但當(dāng) NaCl 的濃度超過了微生物的承受能力則會導(dǎo)致生物反應(yīng)器性能下降[13-14].另有一些研究表明,高濃度的 NaCl 會限制生物反應(yīng)器對有機物的去除[15-16],如 Windey 等[17]發(fā)現(xiàn)當(dāng)NaCl的濃度達(dá)到30g/L時,生物反應(yīng)器中微生物的活性下降 59%.在本研究中,不同的 NaCl濃度導(dǎo)致不同的結(jié)果,不同的 NaCl 濃度的添加方式也會導(dǎo)致不同的結(jié)果.如果直接將40g/L和70g/L NaCl加入到陽極液中,MFC運行幾個周期后就沒有電能輸出;但當(dāng)NaCl濃度從20g/L逐步提高70g/L NaCl 后,MFC 依然有電能輸出.這一點從圖1A可知,加入 20g/L NaCl,最大輸出電壓下降10%,加入 40g/L NaCl,最大輸出電壓又下降了10%,即使在70g/L NaCl的情況下,MFC依然可以對外輸出電能.因此,逐步提升 NaCl濃度可以使MFC 更容易適應(yīng)高鹽度,今后,培養(yǎng)和馴化耐鹽細(xì)菌將非常有利于MFC去除高鹽度廢水.

除了限制電能輸出,高鹽度同樣會影響MFC陽極微生物的群落及其多樣性.基于DGGE圖片(圖4)可知,當(dāng)鹽度從0提高到40g/L時,陽極微生物群落結(jié)構(gòu)變化并不明顯;但當(dāng)鹽度繼續(xù)提高到70g/L 時,群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化,一些細(xì)菌如Enterobactersp. (Band 3)和Shewanella sp.(Band 4)很可能由于不能適應(yīng)高鹽度而消失了.Wu 等[16]也認(rèn)為鹽度很明顯地影響生物反應(yīng)器的微生物群落結(jié)構(gòu),但 Lefebvre 等[18]卻發(fā)現(xiàn)NaCl濃度即使提高到120g/L,微生物群落結(jié)構(gòu)也沒有明顯地變化. 兩位學(xué)者研究結(jié)果的差別可能是由于后者的生物反應(yīng)器經(jīng)過長期運行后,很多菌種已經(jīng)適應(yīng)了高鹽度的環(huán)境.

有報道表明,NaCl濃度大于 1%就很可能使微生物細(xì)胞脫水,從而限制其活性[19-20].但這種限制很可能是暫時的,在本研究中,高鹽度可以明顯地限制 MFC 陽極微生物的活性,但鹽度一旦解除了,MFC 的產(chǎn)電能力可以迅速恢復(fù).這說明高鹽度僅僅是暫時限制了微生物的活性.

微生物脫鹽電池(MDC),由于其能夠去除有機物污染物、去除廢水的鹽度同時對外輸出電能[22],從而引起了國內(nèi)外廣泛的關(guān)注.然而,MDC在脫鹽的過程中,越來越多的鹽離子進(jìn)入陽極會導(dǎo)致陽極的鹽度迅速提升,鹽度的升高很可能會影響 MDC脫鹽和產(chǎn)電的性能.這些研究結(jié)果可以為研究高鹽度下MDC的性能提供一些依據(jù).

4 結(jié)論

4.1 當(dāng)向 MFC中依次添加 0,20,40,60,70g/L NaCl, MFC的最大輸出電壓從 660mV下降到130mV,同時庫侖效率也從 67%下降到 4%.這表明逐步添加 NaCl,即使鹽度高達(dá) 70g/L NaCl,MFC仍有電能輸出.

4.2 向 MFC(MFC-B 和 MFC-C)中直接添加40g/L和70g/L NaCl并運行兩個周期后,MFC無電能輸出,然而,停止添加 NaCl(鹽度解除)后MFC產(chǎn)電性能能夠迅速恢復(fù).

4.3 當(dāng)鹽度高于 40g/L NaCl時,陽極微生物群落發(fā)生明顯變化,一些不適應(yīng)高鹽度的群種的優(yōu)勢度下降,取而代之的是一些能夠適應(yīng)高鹽度的菌種.

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