■ 蘇松坤 陶挺 繆曉青

（作者蘇松坤單位為福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院、浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院；陶挺單位為浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院；繆曉青單位為福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院）

由同一只蜂王產(chǎn)下的受精卵發(fā)育成的幼蟲若在整個(gè)幼蟲期都喂蜂王漿，幼蟲只需13天就發(fā)育成性器官完全的蜂王；若在前三天喂蜂王漿，之后喂蜂糧(蜂蜜和花粉的混合物)，幼蟲18天后才發(fā)育成性器官不完全的工蜂。蜂王在繁殖高峰期，每天的產(chǎn)卵數(shù)達(dá)到2000粒，超過自身的體重。蜂王漿的壽命一般是2~3年，而工蜂壽命只有30~40天。蜂王漿神奇的功效引起了許多科學(xué)家極大的興趣。

蜂王漿(Royal Jelly, RJ)是哺育蜂咽下腺與上顎腺分泌的供3日齡以內(nèi)蜜蜂幼蟲和蜂王食用的漿狀物質(zhì)。蜂王漿中一般含水量為64.5～68.5%，蛋白質(zhì)12～14%，碳水化合物8.5～16%，脂類6%，灰分0.4～2%，其它物質(zhì)2.84～3%。其中王漿蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白組成，水溶性蛋白占總蛋白含量的46～89%，為王漿蛋白的主要部分，稱為王漿主蛋白 (MRJPs, Major Royal Jelly Proteins)。

人類對(duì)蜂王漿的認(rèn)識(shí)有200多年的歷史。葛鳳晨研究員等考證了17世紀(jì)中國人采集利用東方蜜蜂王漿的歷史，并在文中指出了下列事實(shí)：1792年弗郎克斯·哈伯(Francois Huber)首次提出王漿一詞；1852年美國朗斯特羅什先生收集了足夠數(shù)量的蜂王漿請(qǐng)化學(xué)家對(duì)蜂王漿的成分進(jìn)行分析研究；1888年德國化學(xué)家A. Von. Pianta對(duì)蜂王漿的組分進(jìn)行一般性的研究；20世紀(jì)20年代，加拿大一養(yǎng)蜂者隨意將蜂群中多余王臺(tái)削下來被母雞吃掉，第二天母雞產(chǎn)下一個(gè)較大的雞蛋，這一發(fā)現(xiàn)引起科學(xué)家的注意。從此，蜂王漿的研究和利用歷史事例越來越多，但對(duì)蜂王漿進(jìn)行包括生物學(xué)、化學(xué)、藥理和臨床實(shí)驗(yàn)的全面研究，還是最近幾十年才開始的，至今人們對(duì)蜂王漿中的一些微量生物活性物質(zhì)還未完全研究清楚。

蜂王漿的許多功能與其所含的蛋白組分有關(guān)，但由于其組成復(fù)雜，且有些成分在分離過程中易失活，因此很多研究都集中在王漿整體水平上，而未闡明王漿為什么會(huì)有這些功能，怎樣產(chǎn)生這些功能，是哪種組分產(chǎn)生了這些功能；受試對(duì)象也主要集中在動(dòng)物個(gè)體水平，而鮮有達(dá)到細(xì)胞分子水平。

對(duì)王漿蛋白單一組分研究的缺乏限制了其應(yīng)用范圍，近年來，隨著基因工程、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及現(xiàn)代分析、分離技術(shù)的發(fā)展，一些蛋白組分已經(jīng)得到分離或在大腸桿菌中得到表達(dá)并進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)，這對(duì)進(jìn)一步闡明王漿蛋白組分的生理生物活性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，無疑具有重要意義的。

王漿蛋白功能呈多樣化

蜂王漿整體水平功能研究的全面鋪開已有幾十年的歷史，主要表現(xiàn)為免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、促細(xì)胞生長、促繁殖、抗疲勞、降血壓、預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防甲狀腺素誘導(dǎo)的肝損害、營養(yǎng)神經(jīng)等功能；近幾年來，王漿中的某些單一蛋白組分，如MRJP3、Jelleine-I-IV、Royalisin、MRJP1、57-kDa蛋白、Apisimin等也己得到分離或表達(dá)，并進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)。

免疫調(diào)節(jié)功能

早在1996年，Lidija sver等就發(fā)現(xiàn)王漿通過刺激抗體產(chǎn)生和免疫活性細(xì)胞增殖而起到免疫調(diào)節(jié)的作用，但人們還不知道到底是何種組分發(fā)揮了作用。在隨后的研究中，人們還發(fā)現(xiàn)王漿能抑制DNP-KLH小鼠的過敏反應(yīng)和NC/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣病變。但是只有Iwao Okamoto等的研究揭示了MRJP3的抗過敏作用。他們通過OVA/alum免疫小鼠經(jīng)anti-CD3刺激衍生的脾細(xì)胞抑制IL-4的產(chǎn)生從王漿中篩選抗過敏因子，采用一系列柱色譜分析，分離純化了一個(gè)70 kDa的糖蛋白，即MRJP3。

體外試驗(yàn)表明，MRJP3不僅能抑制IL-4的產(chǎn)生，還能通過抑制T細(xì)胞增殖而抑制IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生。更有意思的是，MRJP3作為外源蛋白本身具有抗原性，經(jīng)腹膜注射能抑制免疫小鼠血清anti-OVA IgE和IgG1的水平，而熱處理能降低其抗原性。這些結(jié)果表明MRJP3在體內(nèi)外均有免疫調(diào)節(jié)的作用并可能會(huì)被應(yīng)用于臨床治療。

抗菌功能

Renato Fontana等從蜂王漿中分離了四種抗菌肽，這些抗菌肽屬于同一個(gè)蛋白質(zhì)家族Jelleines，并分別命名為Jelleine-I、Jelleine-II、Jelleine-III、Jelleine-IV。研究人員通過氨基酸測(cè)序，體外合成、純化，進(jìn)行了一系列的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。他們通過測(cè)定抗菌肽的抗菌活性、肥大細(xì)胞脫顆?；钚院腿苎囼?yàn)，發(fā)現(xiàn)Jelleine-I-III對(duì)酵母、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌有特異性抗菌作用，而Jelleine-IV在所有的試驗(yàn)中均表現(xiàn)抗菌性。這些抗菌肽與蜜蜂體內(nèi)的其它抗菌肽沒有任何相似之處，它們由工蜂產(chǎn)生并分泌到王漿中。研究人員通過數(shù)據(jù)庫檢索比對(duì)，還發(fā)現(xiàn)Jelleine-II C-末端 9個(gè)氨基酸序列與王漿中MRJP1 C-末端 9個(gè)氨基酸序列完全一致，提示Jelleine-II可能是MRJP1經(jīng)胰蛋白酶作用后的產(chǎn)物。通過胰蛋白酶部分具蛋白質(zhì)外切酶活性片斷的作用，MRJP1還能形成Jelleine-I和Jelleine-IV，提示MRJP1可能是Jelleine的前體物質(zhì)。

Katarina Bachanova等報(bào)道了王漿中一種新的抗菌多肽Royalisin，并發(fā)現(xiàn)Royalisin對(duì)蜜蜂美洲幼蟲腐臭病病原(Paenibacillus larvae)及其他受試革蘭氏陽性菌有殺滅作用。

抗腫瘤功能

Claudia Bincoletto等在2005年發(fā)現(xiàn)王漿能阻礙因腫瘤細(xì)胞生長而導(dǎo)致的骨髓抑制，但成分未知。斯洛伐克學(xué)者Juraj Majtan等運(yùn)用基因工程的方法，在體外表達(dá)了重組的Apa1并進(jìn)行了功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其能刺激巨噬細(xì)胞釋放腫瘤細(xì)胞壞死因子(TNFα)。令人感興趣的是，重組Apa1經(jīng)胰蛋白酶部分消化后，其免疫刺激功能顯著增強(qiáng)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，Apa1的N-端重組片斷較其它三個(gè)蛋白片斷活性最強(qiáng)。

促細(xì)胞生長功能

日本科學(xué)家Masaki Kamakura等研究了王漿57-kDa蛋白的生理學(xué)作用，他們通過對(duì)大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)57-kDa蛋白能顯著地促進(jìn)肝細(xì)胞的DNA合成，而常用的牛血清卻無此作用。此外，57-kDa蛋白還能增加清蛋白（亦叫白蛋白）的合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示57-kDa蛋白可能起到細(xì)胞分裂素的作用。隨后，57-kDa蛋白的作用機(jī)理也被闡明。2002年被K.Bilikova,J.Hanws等人發(fā)現(xiàn)的小肽Apisimin在隨后的實(shí)驗(yàn)中也被證明有刺激人單核細(xì)胞增殖的作用。

L.A.Salazar-Olivo等從王漿中提取粗蛋白(RJCP)并發(fā)現(xiàn)其能刺激昆蟲Tn-5B1-4細(xì)胞生長，每毫克蛋白添加劑能使細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組多6.5倍，而通常用的胎牛血清卻只有2.55倍，這些粗蛋白與用硫化胺從王漿中沉淀的RJP30和RJP60效果一樣，都能影響細(xì)胞的形狀，刺激細(xì)胞的粘附。

RJP30能夠刺激鼠科動(dòng)物的3T3-F442A前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟脂肪細(xì)胞，其效果比胰島素好2倍，粗蛋白和RJP60也有類似效果。RJP30還能對(duì)海拉人類子宮癌細(xì)胞產(chǎn)生生長抑制作用，用RJP30處理七天后，細(xì)胞數(shù)目減少2.5倍。以上結(jié)果表明了王漿蛋白對(duì)于細(xì)胞生長作用的多樣性，它對(duì)昆蟲、鼠科動(dòng)物和人類癌細(xì)胞分別有促生長、促分化和抑制生存的作用。

抗高血壓功能

ToshiroMatsui等報(bào)道完全蜂王漿和它的分離蛋白根本不會(huì)阻礙血管緊縮素I－轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性，然而，蜂王漿經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解后，其產(chǎn)物具有抑制血管緊縮素的作用，從而起到降血壓的作用。采用液相色譜法對(duì)王漿水解產(chǎn)物進(jìn)行分離，獲得二肽、三肽片斷，并發(fā)現(xiàn)了11個(gè)ACE的抑制肽，其中有8個(gè)肽是首次從自然資源中鑒定出來的。因此，王漿蛋白被認(rèn)為是一種可通過胃腸酶水解獲取ACE抑制肽的好資源。陶挺等（2008）報(bào)道在家蠶細(xì)胞和幼蟲體內(nèi)成功表達(dá)中華蜜蜂MRJP1蛋白，經(jīng)Western檢測(cè)證實(shí)，純化獲得中華蜜蜂MRJP1蛋白表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)中華蜜蜂MRJP1蛋白表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶解，質(zhì)譜鑒定在中華蜜蜂MRJP1蛋白表達(dá)產(chǎn)物酶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)抗高血壓二肽（Ile-Phe）。

其它功能

鑒于王漿蛋白組分的復(fù)雜性，其功能也呈現(xiàn)多樣化，Stefan Albert等曾指出MRJPs是在進(jìn)化過程中產(chǎn)生功能分歧的。除了以上幾種主要功能外，以下功能也已經(jīng)見諸報(bào)道。

Kamakura M等報(bào)道王漿有抗疲勞作用，這可能與王漿中57-kDa蛋白有關(guān)，且與其含量高低呈劑量效應(yīng)。

2011年4月24日，《Nature》報(bào)道了日本富山縣立大學(xué)鐮倉昌樹博士發(fā)現(xiàn)蜂王漿中的一種57-kDa蛋白（也稱Royalactin）使蜜蜂幼蟲變成蜂王。這種蛋白質(zhì)在果蠅上有類似的效果。研究發(fā)現(xiàn)，royalactin能激活一種叫做p70 S6激酶，這個(gè)激酶對(duì)幼蟲體型的變大有重要的作用，它能夠增加細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶的活性（該酶在縮短蟲體發(fā)育時(shí)間中起重要作用），提高卵巢管發(fā)育必需的保幼激素水平。鐮倉昌樹研究發(fā)現(xiàn)，敲除蜜蜂和果蠅脂肪體中的表皮生長因子受體（Egfr），能阻礙royalactin誘導(dǎo)的所有形態(tài)變化。這些研究表明，royalactin是蜂王漿中的一個(gè)通過Egfr-調(diào)節(jié)信號(hào)通道來誘導(dǎo)幼蟲發(fā)育成為蜂王的特殊因子。經(jīng)蛋白氨基酸分析比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Royalactin的一級(jí)結(jié)構(gòu)與MRJP1的結(jié)構(gòu)相同。

王漿蛋白的分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀

上個(gè)世紀(jì)，由于科學(xué)發(fā)展水平的限制，人們主要采用化學(xué)分析的方法對(duì)王漿組分進(jìn)行粗略的分析及王漿整體水平上的功能實(shí)驗(yàn)；然而，這些方法已經(jīng)無法滿足功能如此紛繁復(fù)雜的王漿蛋白分析的需要。目前，人們迫切需要知道的是在這些復(fù)雜的功能背后，到底是何種組分發(fā)揮了作用，到底存在怎樣的作用機(jī)制。

本世紀(jì)，王漿蛋白分子水平的研究悄然展開，這得益于現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。2006年10月26日，《Nature》雜志發(fā)表了蜜蜂基因組的全序列；隨后，《Science》雜志也在當(dāng)年10月27日和12月15日相繼發(fā)表了三篇評(píng)論，指出了蜜蜂基因組序列對(duì)于研究昆蟲的進(jìn)化和社會(huì)性行為的重要意義。這一歷史性的成果標(biāo)志著蜜蜂基因組研究工作的大跨越，必將對(duì)以后蜜蜂基因功能和王漿蛋白功能的研究產(chǎn)生重大影響。

目前，王漿蛋白的分子水平方面的研究主要集中在MRJPs家族，目前已知的成員有MRJP1、MRJP2-4、MRJP5、MRJP6-8。Drapeau MD等報(bào)道了MRJP9，還指出了MRJPs基因家族中一個(gè)新的假基因編碼一個(gè)不完整的多肽，這個(gè)多肽可能成為MRJPs家族的第十個(gè)成員，研究人員還將這個(gè)基因命名為MRJP-ψ。其中MRJP2、MRJP3、MRJP5基因均存在重復(fù)序列多態(tài)性；而MRJP3-5、MRJP7基因則均存在單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。

MRJPs包含大量的必須氨基酸，在蜜蜂的營養(yǎng)中起著重要作用。另外，多態(tài)重復(fù)區(qū)域在MRJPs基因家族進(jìn)化中出現(xiàn)得很早，這也可能與蜜蜂增加自身氮儲(chǔ)藏量，保證自身營養(yǎng)有關(guān)。在近來的研究中，有關(guān)MRJP1的報(bào)道頻頻出現(xiàn)。MRJP1是一個(gè)分子量約為56-57kDa的糖蛋白。它具有高度的保守性，且在王漿中含量最豐富。不同于其它家族成員的是，Kucharski, R等報(bào)道MRJP1在蜜蜂大腦的蘑菇體表達(dá)，提示MRJP1可能在蜜蜂的行為中起作用。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也被應(yīng)用到王漿蛋白研究中，Scarselli R等用蛋白質(zhì)雙向電泳、質(zhì)譜、de novo測(cè)序技術(shù)研究了王漿的蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了MRJP1-3的前體及幾個(gè)MRJP1和MRJP3的片斷，這可能是由于王漿中存在蛋白酶的原因。Keity Souza Santos等同樣用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)，從王漿中分離了61個(gè)多肽點(diǎn)，其中34個(gè)已經(jīng)確定，有27個(gè)蛋白質(zhì)是MRJPs成員。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，中國科學(xué)家建立了MRJP5作為蜂王漿新鮮度指標(biāo)的免疫檢測(cè)方法。

本實(shí)驗(yàn)室在這方面進(jìn)行了積極的探索，構(gòu)建了中華蜜蜂（Apis cerana cerana）8日齡的工蜂頭部cDNA，成功克隆了編碼中華蜜蜂王漿主蛋白基因MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP5、Apisimin的全長cDNA序列，并對(duì)它們的全序列進(jìn)行了測(cè)定與分析。此外，還發(fā)現(xiàn)了中蜂MRJP2基因一個(gè)新的多態(tài)重復(fù)區(qū)域。并在原核表達(dá)（大腸桿菌等）系統(tǒng)和真核表達(dá)（家蠶等）系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)和產(chǎn)物功能研究，取得可喜進(jìn)展。

歷史契機(jī)成有力研究工具

在各國科學(xué)家的不斷努力和探索下，王漿蛋白的功能研究已經(jīng)取得了不少進(jìn)展，且已成為當(dāng)前蜂王漿研究的熱點(diǎn)。人類的實(shí)踐也已證明王漿蛋白的諸多優(yōu)良生物活性，但鑒于其成分的復(fù)雜性和功能的多樣化，仍有許多問題亟待解決。分離純化王漿中的功能蛋白或?qū)⑼鯘{主蛋白基因克隆表達(dá)并闡明其作用機(jī)理，已成為當(dāng)務(wù)之急?，F(xiàn)代分析分離技術(shù)及基因工程、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和蜜蜂基因組測(cè)序的完成，又給這一研究帶來了歷史性的契機(jī)，成為這一研究強(qiáng)有力的工具。

而王漿也不僅僅只用于人類保健品和相關(guān)藥品的生產(chǎn)，更會(huì)應(yīng)用到諸如細(xì)胞培養(yǎng)、組織工程等領(lǐng)域，促進(jìn)科學(xué)技術(shù)和人類社會(huì)的發(fā)展。我們有理由相信，在全球科學(xué)家的共同努力下，闡明王漿蛋白復(fù)雜的組分及其功能不再是一個(gè)神話。