李慧一，曹風(fēng)雅，胡瀾也，佘凱芩，崔澤林

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，上海 200025

金黃色葡萄球菌可引起心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎、腦膜炎等[1,2]，是重要的條件致病菌和醫(yī)院內(nèi)感染細(xì)菌[3]。近70年來(lái)，由于抗生素的廣泛使用，金黃色葡萄球菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)。20世紀(jì)40年代第1種抗生素——青霉素問(wèn)世，金黃色葡萄球菌很快對(duì)其產(chǎn)生耐藥；隨后甲氧西林開(kāi)始應(yīng)用，但1年后便出現(xiàn)新的耐藥菌株——耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)；80年代萬(wàn)古霉素在臨床廣泛應(yīng)用，耐萬(wàn)古霉素菌株很快出現(xiàn)[4]；之后利奈唑胺和達(dá)普霉素作為對(duì)抗MRSA的新型藥物，目前已有耐藥菌株報(bào)道[5]。這些耐藥菌株不斷增多，且在世界范圍內(nèi)流行，特別是MRSA。在美國(guó)1999～2005年因感染MRSA而入院的患者增加1倍多，其中被診斷為敗血癥的患者增加81.2%[6]。在此形勢(shì)下，即使投入大量資金繼續(xù)研究新型抗生素，耐藥問(wèn)題仍無(wú)法得到解決，因此尋找控制耐藥菌的新對(duì)策十分迫切。目前有望替代抗生素的控菌手段有抗菌肽、噬菌體等。其中，噬菌體的發(fā)現(xiàn)早于抗生素，后因抗生素的普及而被忽視。在細(xì)菌耐藥問(wèn)題日趨嚴(yán)峻的現(xiàn)在，人們?cè)俅螌?duì)噬菌體及其裂解酶的控菌效果予以關(guān)注。本文就噬菌體及其裂解酶控制金黃色葡萄球菌的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1 噬菌體及其衍生物控制細(xì)菌感染的概況

D′ Herelle在1917年第1次提出用噬菌體消滅細(xì)菌性病原[7]。1919年，法國(guó)巴黎的一家醫(yī)院首次對(duì)感染志賀菌的痢疾患者注射噬菌體，使年輕患者迅速恢復(fù)[8]，但這次治療并未立即報(bào)道。噬菌體治療人類疾病的案例首次報(bào)道于1921年——Richard Bruynoghe和Joseph Maisin 使用噬菌體治療葡萄球菌引起的皮膚病[9]。20世紀(jì)40年代，Eli Lilly公司生產(chǎn)了7種用于人體的噬菌體制劑，其中包括抗葡萄球菌制劑[10]。第二次世界大戰(zhàn)期間，研究人員使用葡萄球菌等細(xì)菌噬菌體混合物制劑以控制傷者感染。遺憾的是，早期的噬菌體治療并不規(guī)范，而且對(duì)噬菌體的認(rèn)識(shí)不夠全面，加之青霉素這一能顯著控制細(xì)菌感染的抗生素問(wèn)世并大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，使許多西方國(guó)家放棄了噬菌體療法[8]。從20世紀(jì)40年代的耐青霉素金黃色葡萄菌到60年代的MRSA，耐藥金黃色葡萄球菌的流行越來(lái)越引起人們的關(guān)注[11]，開(kāi)發(fā)新型抗生素尤為迫切。但由于抗生素的篩選作用，細(xì)菌終將進(jìn)化對(duì)其耐藥，將噬菌體作為一種控制細(xì)菌的手段，重新引起研究者的重視。

盡管西方國(guó)家曾一度放棄噬菌體療法，但一些學(xué)者仍一直從事噬菌體的研究。迄今為止，噬菌體作為細(xì)菌感染的非傳統(tǒng)療法近1個(gè)世紀(jì)，作為基因研究工具達(dá)半個(gè)世紀(jì)，作為探究特異性靶向結(jié)合蛋白的工具約20年，作為疫苗工具或基因傳遞媒介近10年[12]。噬菌體作為細(xì)菌感染的療法在波蘭、蘇聯(lián)等國(guó)家取得成功[13]。20世紀(jì)80年代，應(yīng)用金黃色葡萄球菌噬菌體治療肺和胸膜化膿性患者顯示出有效性且無(wú)不良反應(yīng)[9]。近來(lái)，美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)允許在食品加工過(guò)程中使用噬菌體以控制細(xì)菌數(shù)目[13]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將噬菌體應(yīng)用于奶酪、牛奶、海鮮等即食產(chǎn)品的加工過(guò)程，對(duì)控制引發(fā)食源性疾病的病原體是有效的[14]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，噬菌體也表現(xiàn)出其有效控制耐藥金黃色葡萄球菌的能力。2005年，Wills等應(yīng)用利奈唑胺和裂性噬菌體聯(lián)合治療小鼠糖尿病足，使MRSA感染得到有效控制[15]。一些用于臨床的噬菌體也表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺菌能力，能有效控制燒傷患者的感染[7]。目前關(guān)于噬菌體裂解酶的研究結(jié)果表明，其具有控制細(xì)菌的能力[2]。

2 噬菌體及其裂解酶控制金黃色葡萄球菌的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)

在進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段前，噬菌體控制細(xì)菌感染的有效性及是否有不良反應(yīng)需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。1992年，Soothill嘗試用小鼠模型驗(yàn)證金黃色葡萄球菌噬菌體Φ 131的保護(hù)作用，但不幸的是，實(shí)驗(yàn)未取得成功。因此，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平上噬菌體能治療金黃色葡萄球菌感染的說(shuō)法一直未被證實(shí)[3]。近年來(lái)，研究人員對(duì)噬菌體愈發(fā)關(guān)注，希望能找到理想噬菌體來(lái)控制耐藥菌感染，同時(shí)通過(guò)許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)證明其有效性(表1)。2003～2011年，日本、意大利、印度和中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的研究者們通過(guò)建立小鼠腹腔感染模型或靜脈內(nèi)注射感染模型，對(duì)噬菌體Φ MR11、Msa、Φ MR25、P-27/HP、Stau2和P954能否控制金黃色葡萄球菌感染進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，在建立的動(dòng)物模型中，噬菌體能控制金黃色葡萄球菌引起的致死性感染，且未觀察到不良反應(yīng)。另外，英國(guó)的研究人員通過(guò)建立家兔傷口感染致膿腫模型，證明噬菌體LS2a能有效預(yù)防金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的膿腫形成。加拿大的研究人員證明，在泌乳奶牛的亞臨床乳腺炎模型中，噬菌體K能治愈患病的泌乳奶牛。這些研究結(jié)果使人們對(duì)應(yīng)用噬菌體控制金黃色葡萄球菌感染抱有極大希望。

隨著耐藥菌的增多，噬菌體的優(yōu)勢(shì)被更多學(xué)者認(rèn)可。但多年來(lái)金黃色葡萄球菌噬菌體生物學(xué)特性及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究表明，噬菌體的制備、保存、作用條件等方面存在較多局限性。與抗生素類似，細(xì)菌也可能會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性，然而大自然中噬菌體的多樣性和變異性也為噬菌體控制細(xì)菌提供了不竭的資源庫(kù)。此外，具有對(duì)細(xì)菌外圍基本組成骨架有破壞作用的噬菌體裂解酶可彌補(bǔ)細(xì)菌產(chǎn)生噬菌體抗性的不足。因此，噬菌體裂解酶作為抗菌藥物的候選者越來(lái)越引起關(guān)注(表2)。美國(guó)研究者通過(guò)基因工程獲取3種不同的ClyS，證明其在各種小鼠模型中控制金黃色葡萄球菌感染的有效性。此外，韓國(guó)、愛(ài)爾蘭和德國(guó)的研究者對(duì)噬菌體裂解酶在體外抗金黃色葡萄球菌的作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示噬菌體裂解酶具有良好的抗金黃色葡萄球菌作用。

表1噬菌體在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平控制金黃色葡萄球菌的研究進(jìn)展

Tab.1 Research progress on bacteriophage control ofStaphylococcusaureusinvivo

時(shí)間(年份)地點(diǎn) 噬菌體噬菌體類型噬菌體來(lái)源動(dòng)物模型結(jié)論是否觀察到不良反應(yīng)2003日本Φ MR11[3]長(zhǎng)尾噬菌體科162名健康者和高知醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院患者的鼻腔分泌物小鼠腹腔感染模型控制金黃色葡萄球菌引起的致死性感染,小鼠存活。Φ MR11迅速出現(xiàn)在血液循環(huán)中且一直保持高水平,直至細(xì)菌根除否2005英國(guó)LS2a[16]———污水家兔傷口感染致膿腫模型在感染金黃色葡萄球菌的家兔模型中,能有效預(yù)防膿腫形成。膿腫面積和細(xì)菌數(shù)目隨噬菌體劑量減少而逐漸增加否2006加拿大K[17]肌尾噬菌體科泌乳奶牛的乳汁泌乳奶牛的亞臨床乳腺炎模型24只因感染金黃色葡萄球菌而患亞臨床乳腺炎的泌乳奶牛治愈否2007意大利Msa[18]———那不勒斯費(fèi)德里克二世大學(xué)醫(yī)學(xué)院住院患者小鼠靜脈內(nèi)注射感染模型使97%接種致死量金黃色葡萄球菌A170的小鼠免于死亡;接種非致死量的小鼠于感染10 d后再接種噬菌體,細(xì)菌也能完全清除。噬菌體Msa能有效預(yù)防膿腫形成,減少膿腫重量和細(xì)菌荷載量否2010日本Ф MR25[19]長(zhǎng)尾噬菌體科日本高知醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院患者的鼻腔分泌物小鼠腹腔感染模型給已接種致死劑量金黃色葡萄球菌SA37的小鼠腹腔內(nèi)注射Ф MR25能使其免于死亡。Ф MR25的治療效果取決于噬菌體劑量否2010印度P-27/HP[20]———印度的污水小鼠感染模型小鼠免于患菌血癥及繼發(fā)死亡。在為期3 d的治療中,金黃色葡萄球菌P-27/HP CFU在脾中的數(shù)目明顯減少6 log(99.9%)否2010中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)Stau2[21]肌尾噬菌體科中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)衛(wèi)生署南投醫(yī)院收集的氣管導(dǎo)管吸出物小鼠腹腔感染模型使感染金黃色葡萄球菌的小鼠100%免于致死性感染。其抗菌譜比多價(jià)噬菌體K寬(47%)否2011印度P954[13]短尾噬菌體科印度恒河小鼠腹腔感染模型使感染金黃色葡萄球菌LD80的小鼠免于死亡?；加兄行粤＜?xì)胞減少癥的小鼠單獨(dú)接種噬菌體P954無(wú)中毒或死亡現(xiàn)象,證明了噬菌體P954的安全性否

表2金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶在體內(nèi)外控制金黃色葡萄球菌的研究進(jìn)展

Tab.2 Research progress on lysin control ofStaphylococcusaureusinvivoandinvitro

年份地點(diǎn)酶名稱獲取途徑動(dòng)物模型/體外結(jié)論2009韓國(guó)SAL-2[22]由噬菌體SAP-2的基因編碼所得,將該基因?qū)氪竽c埃希菌中表達(dá)出SAL-2體外SAL-2對(duì)金黃色葡萄球菌(包括MR-SA)有特異溶解活性。SAL-2的最低有效抑制濃度約為1 μ g/ml。與噬菌體SAP-2相比,SAL-2在去除金黃色葡萄球菌生物膜時(shí)有更寬的抗菌譜2010美國(guó)ClyS[2]由金黃色葡萄球菌Twort噬菌體裂解酶的N端催化結(jié)構(gòu)域和另一金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Φ NM3的細(xì)胞壁靶區(qū)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成小鼠鼻腔非定植模型單獨(dú)接種ClyS 1 h后可見(jiàn)鼻腔黏膜中MRSA活性去除率呈2 log下降小鼠敗血癥模型 被MRSA感染,本該因細(xì)菌性膿毒癥于24 h內(nèi)死亡的小鼠接受腹膜內(nèi)注射ClyS后存活小鼠腹腔感染模型一定劑量的ClyS或苯唑西林單獨(dú)使用,小鼠的存活率低且與對(duì)照組無(wú)顯著差異;若ClyS與苯唑西林聯(lián)合使用,則能通過(guò)協(xié)同作用使小鼠免于MRSA導(dǎo)致的敗血癥死亡2011愛(ài)爾蘭CHAPk[23]由含3個(gè)結(jié)構(gòu)域的抗葡萄球菌噬菌體裂解酶LysK 衍生出來(lái)的單一結(jié)構(gòu)域體外CHAPk的抗菌譜包括所有葡萄球菌種。在pH 9、15 ℃時(shí),該酶活性最高。CHAPk比溶葡萄球菌酶作用更快2011德國(guó)PRF-119[24]由噬菌體K細(xì)胞內(nèi)溶素(LysK)的CHAP結(jié)構(gòu)域和溶葡萄球菌素的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)構(gòu)成體外PRF-119對(duì)該實(shí)驗(yàn)中所有被測(cè)試的金黃色葡萄球菌菌株(包括MRSA分離株)都具有較高的抗菌活性2012美國(guó)ClyS[25]鏈球菌λ SA2細(xì)胞內(nèi)溶素的肽鏈內(nèi)切酶域分別融合來(lái)自溶葡萄球菌酶的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來(lái)自葡萄球菌噬菌體K細(xì)胞內(nèi)溶素的細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域小鼠乳腺炎模型 2種融合蛋白均能殺死從牛乳腺炎分離出的16種金黃色葡萄球菌(包括MRSA)2012美國(guó)ClyS[26]由金黃色葡萄球菌Twort噬菌體裂解酶的N端催化結(jié)構(gòu)域和另一金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶Φ NM3的細(xì)胞壁靶區(qū)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成小鼠皮膚感染模型與莫匹羅星相比,在感染小鼠模型中ClyS能根除更多的甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)和MRSA,且不易出現(xiàn)耐藥性

3 與金黃色葡萄球菌噬菌體有關(guān)的臨床試驗(yàn)

金黃色葡萄球菌噬菌體及其裂解酶的療效已被多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，且大部分實(shí)驗(yàn)未觀察到不良反應(yīng)。在投入臨床治療前，需有相關(guān)的臨床試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。但在歐洲和美國(guó)FDA的管轄范圍內(nèi)，目前僅有少數(shù)臨床試驗(yàn)按照現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展[29]。噬菌體難以用于臨床試驗(yàn)，可能有以下原因。①抗生素的普及：抗生素抗菌譜廣，生產(chǎn)技術(shù)成熟且療效好；②安全性：噬菌體裂解細(xì)菌能引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，某些噬菌體攜帶毒素基因，與細(xì)菌整合后引起毒素反應(yīng)；③不易控制：噬菌體在細(xì)菌體內(nèi)可無(wú)限增殖，用于臨床時(shí)難以控制劑量；④專一性強(qiáng)：需明確致病菌才可對(duì)癥使用噬菌體，相對(duì)延緩了治療時(shí)間。

鑒于以上原因，目前噬菌體相關(guān)臨床試驗(yàn)還處于起步階段，研究較少。在處理燒傷傷口時(shí)，細(xì)菌感染帶來(lái)一個(gè)棘手的問(wèn)題——極難治愈的熱損傷。金黃色葡萄球菌是早期燒傷傷口感染的常見(jiàn)病原體，銅綠假單胞菌則是燒傷醫(yī)療中心最常見(jiàn)且致命的病原體。2009年，Merabishvili等用BFC-1處理感染的燒傷傷口。BFC-1是一種高度純化和嚴(yán)格配制的噬菌體“雞尾酒”，包含銅綠假單胞菌噬菌體14/1、PNM 和金黃色葡萄球菌噬菌體ISP(內(nèi)毒素已清除)。這些噬菌體來(lái)源于阿斯特麗德女王軍隊(duì)燒傷中心(Burn Wound Centre, Queen Astrid Military Hospital)分離到的銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。其制備過(guò)程簡(jiǎn)要闡述如下：首先，收集銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒性噬菌體，然后用明確的細(xì)菌菌株進(jìn)行初次篩選，篩選出8種噬菌體；接著用燒傷中心實(shí)際分離出的細(xì)菌菌株進(jìn)行二次篩選，最后篩選出3種合適的噬菌體：PMN、14/1和ISP，將其以1011pfu/ml的濃度于4 ℃儲(chǔ)存。去除內(nèi)毒素，獲得成品BFC-1。經(jīng)患者許可，用配有20G×20號(hào)針頭的注射器吸取3 ml BFC-1，然后用無(wú)菌的噴嘴替代注射器針頭，將BFC-1噴灑在感染的燒傷傷口。BFC-1已被布魯塞爾自由大學(xué)教學(xué)醫(yī)院的倫理會(huì)批準(zhǔn)，并于2007年10月開(kāi)始進(jìn)行臨床試驗(yàn)評(píng)估。截止該文發(fā)表時(shí)，BFC-1已被外敷于8例患者感染的燒傷傷口，沒(méi)有觀察到任何不良反應(yīng)[7]。

2002年Weber-Dabrowska等還報(bào)道，化膿性細(xì)菌(包括金黃色葡萄球菌)感染患者口服噬菌體溶解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其對(duì)中性粒細(xì)胞的更新和功能有影響。試驗(yàn)中42例患者患有鼻炎、癤病、鼻竇炎、創(chuàng)傷后感染、生殖道感染、慢性支氣管炎、尿道感染、肛周膿腫、皮膚感染、雙側(cè)中耳炎。對(duì)照組為8名健康志愿者。噬菌體制劑能殺死從患者中分離的金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)酸克雷白菌、摩氏摩根菌、模擬葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和腐生葡萄球菌?；颊叱掷m(xù)3周口服噬菌體制劑，每日3次，每次5 ml。分別觀察治療前、治療3周后、治療3個(gè)月后的血涂片，比較患者與健康志愿者的中性粒細(xì)胞及其前體和吞噬指數(shù)變化?；颊咧委熐爸行粤＜?xì)胞前體比例高于健康志愿者，治療后繼續(xù)上升；患者治療前中性粒細(xì)胞比例低于健康志愿者，治療后進(jìn)一步下降；患者治療前吞噬指數(shù)低于健康志愿者，治療后進(jìn)一步下降。結(jié)果表明，噬菌體治療有效并加速中性粒細(xì)胞的更新，同時(shí)伴有中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌能力降低。雖然在治療中成熟中性粒細(xì)胞的減少似乎不太有利，但其與患者的康復(fù)密不可分。此研究還發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)久刺激中性粒細(xì)胞的更新可增強(qiáng)人體免疫的第1道防線[27]。

4 結(jié)語(yǔ)

金黃色葡萄球菌能引起致死性感染，其耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重，研究新型抗菌藥物的任務(wù)更加緊迫。噬菌體療法作為一種極具潛力的替代療法，重新引起研究者的關(guān)注。噬菌體療法除能解決耐藥菌株無(wú)藥可治的問(wèn)題，與傳統(tǒng)的抗生素療法相比，還有許多其他優(yōu)點(diǎn)。首先，與抗生素不同，噬菌體能特異殺傷靶細(xì)菌，且不會(huì)因破壞機(jī)體正常菌群而引起繼發(fā)感染[20]；其次，因噬菌體本身能變異，從而有更加多樣的噬菌體能對(duì)耐某些噬菌體細(xì)菌的出現(xiàn)作出迅速反應(yīng)[28]；同時(shí)，噬菌體及其產(chǎn)物對(duì)真核細(xì)胞影響較小，因此不良反應(yīng)相對(duì)較少[19,20]；另外，研究噬菌體療法所用資金與開(kāi)發(fā)一種有效的新型抗生素相比更經(jīng)濟(jì)。

噬菌體療法在20世紀(jì)初被提出，但相關(guān)臨床試驗(yàn)少見(jiàn)。至今研究人員對(duì)噬菌體控制感染性疾病的效果仍存有諸多疑問(wèn)，因此，世界上大多數(shù)地區(qū)并不接受噬菌體療法。雖然噬菌體遺傳學(xué)和生理學(xué)機(jī)制已部分闡明，但若作為一種治療方法，尚缺乏大量正規(guī)臨床試驗(yàn)去證實(shí)其安全性和有效性。在噬菌體制劑獲得臨床應(yīng)用許可之前，需注意以下幾點(diǎn)：噬菌體的鑒定、制劑的效能和生物活性、制作工藝、產(chǎn)品純度、制劑的穩(wěn)定性和儲(chǔ)存條件、無(wú)菌控制[29]。

雖然對(duì)噬菌體的了解還不透徹，但研究人員通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)正嘗試解決其應(yīng)用于臨床時(shí)所面臨的諸多問(wèn)題。2011年P(guān)aul等研制出一種重組的、缺乏裂解能力的金黃色葡萄球菌溫和噬菌體P954，能靶向殺滅細(xì)菌但不裂解宿主菌，且不影響療效，解決了噬菌體裂解細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)[13]。隨著對(duì)噬菌體控制細(xì)菌研究的不斷進(jìn)展，期待噬菌體療法將會(huì)逐步完善，直至成功用于臨床。

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