萬(wàn)衛(wèi)星，薛楊波，王 燕，瞿凌晨，許波華，楊 敏

(1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 無(wú)錫市第四人民醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，江蘇 無(wú)錫 214063； 2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210002； 3. 無(wú)錫江原安迪科分子核醫(yī)學(xué)研究發(fā)展有限公司， 江蘇 無(wú)錫 214063； 4. 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所 衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214063)

冠心病是一種由冠狀動(dòng)脈器質(zhì)性狹窄或阻塞引起的心肌缺血缺氧或心肌壞死的心臟病。冠心病發(fā)病率逐年提高，且呈年輕化趨勢(shì)，據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2011》報(bào)道，截止到2011年，患冠心病人數(shù)已達(dá)2.3億，冠心病已被稱作“人類健康的第一殺手”[1]。臨床前對(duì)于冠心病心肌梗死的發(fā)生機(jī)理、防治方法等的研究，以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的心肌梗死模型為主[2-5]，大鼠因造價(jià)低廉，飼養(yǎng)方便，冠狀動(dòng)脈側(cè)支循環(huán)少，心肌壞死出現(xiàn)早，心率失常發(fā)生率高，重復(fù)性及穩(wěn)定性好，成為制作心肌缺血模型的首選試驗(yàn)動(dòng)物[6-9]。

傳統(tǒng)方法評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠心肌缺血模型以心電圖出現(xiàn)T波改變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)[4]。但此法存在不足：(1)由于方法本身以及手術(shù)的影響使得心功能檢測(cè)易出現(xiàn)多變性，個(gè)體差異較大[10]；(2)心電圖的檢測(cè)具有時(shí)效性，只能在術(shù)前和術(shù)后半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行短時(shí)間檢測(cè)[11]；(3)存在一定的假陽(yáng)性，與病理學(xué)心肌TTC染色驗(yàn)證結(jié)果不符。模型建立的成功與否，是研究心肌缺血疾病的基礎(chǔ)，鑒于傳統(tǒng)方法評(píng)價(jià)心肌缺血模型存在一定的不足，急需尋求精準(zhǔn)評(píng)價(jià)心肌缺血模型的方法。

血流灌注顯像劑13NH3·H2O和葡萄糖代謝顯像劑18F-FDG已廣泛應(yīng)用于臨床，兩種顯像劑聯(lián)合的PET顯像是評(píng)價(jià)心肌存活的“金標(biāo)準(zhǔn)”[12-13]，可以對(duì)缺血心肌存活、預(yù)后和療效進(jìn)行客觀評(píng)估。臨床上采用18F-FDG代謝聯(lián)合13NH3·H2O灌注顯像來(lái)對(duì)心肌缺血程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，本研究擬采用13NH3·H2O 聯(lián)合18F-FDG Micro-PET顯像評(píng)價(jià)臨床前心肌缺血大鼠模型，與傳統(tǒng)T波改變的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行比較。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器與裝置

Sumitomo HM-7型醫(yī)用回旋加速器：日本住友；Sumitomo HM-10型醫(yī)用回旋加速器：日本住友；18F-FDG專用合成模塊：北京派特；Mini-Scan TLC薄層放射性掃描儀：美國(guó)Bio SCAN公司；Matrx VMR型麻醉機(jī)：美國(guó)MATRX公司；Inveon型Micro-PET掃描儀：德國(guó)SIMENS公司；CURIEMENTOR 3型活度計(jì)：德國(guó)PTW公司；ALC-V小動(dòng)物呼吸機(jī)：上海奧爾科特生物科技有限公司； XD-7100型心電圖機(jī)：上海醫(yī)用電子儀器廠；AC 210S型電子天平：德國(guó)Sartorius公司；A10超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；寵物剃毛機(jī)：飛利浦公司。

1.2 主要試劑與耗材

異氟烷麻醉劑：美國(guó) Minrad Inc公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)：美國(guó)sigma公司；水合氯醛：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水：江蘇四環(huán)生物制藥有限公司；碘酒：上海利康消毒高科技有限公司；青霉素：中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司；CM柱：美國(guó) Waters公司；QM柱：美國(guó) Waters公司；H216O水、H218O：上?；ぱ芯吭?。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 13NH3·H2O制備

參照文獻(xiàn)[14-15]，稍作改進(jìn)，方法簡(jiǎn)述如下：采用Sumitomo HM-10型醫(yī)用回旋加速器，

利用16O(p，α)13N核反應(yīng)，經(jīng)戴氏合金(Devarda’s alloy)還原靶水，制備出13NH3·H2O的生理鹽水注射液，并經(jīng)CM柱純化?；疃扔?jì)測(cè)定13NH3·H2O不同時(shí)間的活度，用半對(duì)數(shù)作圖法測(cè)定半衰期，計(jì)算核純度。TLC法測(cè)定產(chǎn)品的放化純度，展開劑為V(丙酸)∶V(丙酮)∶V(水)=1∶3∶2的氯化鈉飽和溶液，載體為薄層層析硅膠板GF254。

2.2 18F-FDG制備

參照文獻(xiàn)[16-18]，稍作改進(jìn)，方法簡(jiǎn)述如下：采用Sumitomo HM-7型醫(yī)用回旋加速器，通過(guò)18O(p，n)18F核反應(yīng)和親核取代反應(yīng)，在FDG專用模塊中全自動(dòng)合成18F-FDG，產(chǎn)品經(jīng)TLC法測(cè)定放化純度，展開劑為95%乙腈，載體為薄層層析硅膠板GF254。

2.3 大鼠心肌缺血模型的建立

參照文獻(xiàn)[10-11]，稍作改進(jìn)，簡(jiǎn)述如下：大鼠稱重，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mg∕100 g)。麻醉后將大鼠仰臥位固定，頸部胸部剪毛并酒精消毒，于頸部開一小口暴露氣管，分離氣管并插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)(頻率48次/min，吸呼比1/2，潮氣量20 mL/kg)。于左鎖骨中線處縱向剪開胸部皮膚約2 cm，鈍性分離肌肉層，于心臟搏動(dòng)最強(qiáng)處開胸(在2至3肋間)。充分撕開心包膜，用環(huán)形鉤將心臟提出胸腔，在左心耳根部下方2 mm處進(jìn)針，6-0號(hào)絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。結(jié)扎后迅速將心臟納回胸腔，縫合胸壁。拔去呼吸機(jī)，使其恢復(fù)自主呼吸。全過(guò)程無(wú)菌操作。

2.4 傳統(tǒng)方法評(píng)價(jià)大鼠心肌缺血模型

2.3節(jié)中，大鼠于麻醉后，參照人體相應(yīng)位置，在四肢皮下插入小動(dòng)物心電圖檢測(cè)儀的針電極，動(dòng)態(tài)檢測(cè)建模前后肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖。以結(jié)扎后心電圖T波改變?yōu)槟Ｐ驮u(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 Micro-PET顯像

2.1節(jié)中大鼠于建模前、后均行13NH3·H2O合并18F-FDG顯像。

2.5.113NH3·H2O顯像

大鼠于Micro-PET掃描前禁食6 h，稱重后，利用異氟烷--氧氣混合氣體(1.5%)麻醉待掃描大鼠，固定于Micro-PET掃描床上，每只尾靜脈注射10 MBq新鮮制備的13NH3·H2O，注射體積為0.2 mL，注射5 min后，行Micro-PET掃描顯像，層厚0.78 mm，矩陣128*128，采集時(shí)間10 min，采集能窗350～650 keV。

2.5.218F-FDG顯像

2.5.1節(jié)中大鼠經(jīng)13NH3·H2O注射后2 h注射18F-FDG進(jìn)行顯像，方法簡(jiǎn)述如下：異氟烷麻醉，尾靜脈注射新鮮制備的18F-FDG，每只10 MBq，注射體積為0.2 mL，注射后，大鼠置于恒溫麻醉艙中，維持麻醉狀態(tài)，注射后60 min，行Micro-PET掃描顯像，掃描方式同13NH3·H2O顯像。

2.5.3數(shù)據(jù)處理

13NH3·H2O 和18F-FDG 的Micro-PET掃描圖像采用OSEM 3D迭代重建，迭代2次，勾畫心肌為感興趣區(qū)，根據(jù)公式

SUVmean=衰減校正后的平均感興趣區(qū)域的放射性活度/每克體重的注射性示蹤劑注入活度

計(jì)算建模前后心肌的放射性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)攝取平均值(SUVmean)，缺損心肌和完整心肌的體積(VOI)及異常心肌占全心體積的百分比。

2.5.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 19.0軟件先經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊再進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性，P<0.01為有極顯著性差異。

2.6 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法驗(yàn)證

顯像結(jié)束后，迅速剪下模型大鼠心臟，用生理鹽水沖洗，除去血污，剔除血管脂肪等心肌組織，吸取水分，稱全心重量。從心尖至心底將心臟切成1～2 mm的切片，放入濃度為2%的TTC溶液中，37 ℃水浴染色15 min，染色后洗去多余染料。梗死部分不被染色，未梗死部分呈紅色。切取梗死區(qū)稱重，計(jì)算梗死心肌占全心重量的百分比即為梗死率。

3 結(jié)果與討論

3.1 13NH3·H2O制備

經(jīng)半對(duì)數(shù)作圖法測(cè)定13NH3·H2O 半衰期約為10 min，核素純度>99%，TLC質(zhì)控結(jié)果顯示，13NH3·H2O產(chǎn)品Rf=0.7，放化純度>99%。

3.2 18F-FDG制備

18F-FDG產(chǎn)品TLC質(zhì)控結(jié)果顯示，產(chǎn)品18F-FDG的Rf=0.43，其放化純度>99%。

3.3 傳統(tǒng)方法評(píng)價(jià)大鼠心肌缺血模型

12只大鼠在進(jìn)行冠脈結(jié)扎法建立心肌缺血模型的手術(shù)結(jié)束后，立即觀測(cè)大鼠心電圖，與正常組心電圖相比(圖1a)，9只出現(xiàn)了T波明顯變化(圖1b)，視為結(jié)扎正確，模型成功。1只大鼠在結(jié)扎時(shí)出現(xiàn)室顫，未出現(xiàn)T波明顯改變，視為模型不成功，1只大鼠為麻醉意外死亡，1只因?yàn)榧毙孕乃ニ劳觥?/p>

a—正常大鼠心電圖；b—心肌缺血模型鼠心電圖圖1 心肌缺血模型鼠心電圖Fig.1 The ECG of myocardial ischemia rat

3.4 Micro-PET顯像

建模前，12只大鼠均利用血流灌注顯像劑13NH3·H2O在注射后5 min進(jìn)行Micro-PET顯像，靜態(tài)掃描圖顯示12只大鼠心肌血流灌注全部正常，整個(gè)心肌攝取放射性物質(zhì)13NH3·H2O均勻，心肌標(biāo)準(zhǔn)攝取平均值為3.78±0.59，Micro-PET掃描圖示于圖2a，由圖2a顯示心肌完整；利用葡萄糖代謝顯像劑18F-FDG在注射60 min后進(jìn)行Micro-PET顯像，靜態(tài)掃描圖示于圖3，由圖3顯示12只大鼠心肌完整，葡萄糖代謝全部正常，心肌18F-FDG攝取均勻，心肌標(biāo)準(zhǔn)攝取平均值為2.30±0.21。

建模后的10只大鼠，利用血流灌注顯像劑13NH3·H2O在注射后5 min進(jìn)行Micro-PET顯像，靜態(tài)掃描圖顯示4只大鼠心肌血流灌注顯像與建模前一致；6只心肌血流灌注異常，部分心肌攝取放射性物質(zhì)13NH3·H2O明顯低于其他大部分心肌，整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)攝取平均值為2.78±0.46(圖2b)。利用葡萄糖代謝顯像劑18F-FDG在注射60 min后進(jìn)行Micro-PET顯像，靜態(tài)掃描圖顯示4只大鼠Micro-PET顯像與建模前一致，6只大鼠心肌糖代謝異常，部分心肌攝取放射性物質(zhì)18F-FDG明顯低于其他大部分心肌，整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)攝取平均值為1.65±0.21(n=6)(圖3b)。13NH3·H2O和18F-FDG的聯(lián)合顯像結(jié)果顯示，傳統(tǒng)方法心電圖顯示的9只建模成功的大鼠中，僅有6只發(fā)現(xiàn)心肌灌注和葡萄糖代謝均異常。

3.5 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法驗(yàn)證

13NH3·H2O和18F-FDG 的Micro-PET圖像顯示心肌攝取異常的6只大鼠，TTC染色后圖片顯示有部分心肌呈蒼白色(圖4)，TTC、心電圖監(jiān)測(cè)、Micro-PET三種評(píng)價(jià)結(jié)果一致，確認(rèn)為建模成功。

Micro-PET顯像正常的4只大鼠，其中3只在建模時(shí)，心電圖出現(xiàn)了T波變化，但在解剖后TTC染色時(shí)，染色均勻，無(wú)異常(見圖5)；另1只在建模時(shí)，心電圖顯示無(wú)T波改變， TTC染色均勻。TTC和Micro-PET評(píng)價(jià)結(jié)果一致，心電圖評(píng)價(jià)假陽(yáng)性。

心電壓評(píng)價(jià)、Micro-PET評(píng)價(jià)及TTC染色結(jié)果比較列于表1。Micro-PET方法評(píng)價(jià)大鼠心肌缺血模型成功的正確率為100%，而傳統(tǒng)心電圖檢測(cè)的方法評(píng)價(jià)大鼠心肌缺血模型成功的正確性僅為66.67%。

a—建模前；b—建模成功圖2 13NH3·H2O的Micro-PET掃描圖Fig.2 The Micro-PET scan picture of 13NH3·H2O

a—建模前；b—建模成功圖3 18F-FDG的Micro-PET掃描圖Fig.3 The Micro-PET scan picture of 18F-FDG

動(dòng)物編號(hào)心電圖結(jié)果13NH3·H2O顯像18F-FDG顯像TTC染色SUVmean建模前建模后*灌注異常心肌體積百分比(%)SUVmean建模前建模后#代謝異常心肌體積百分比(%)梗死率(%)1+4.313.2428.362.091.6725.4645.862+3.262.3724.952.451.5228.4027.393+4.283.1918.321.961.4119.4221.874+3.693.0030.432.131.8623.8135.695+3.942.8929.611.821.4435.4646.616+2.691.9733.342.631.9821.3938.477+2.872.960.002.332.690.000.008+4.224.080.001.851.940.000.009+3.893.850.002.292.110.000.0010-3.743.810.002.312.470.000.00

注：*：與建模前相比，建模成功的6只心肌攝取13NH3·H2O有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p<0.05；

#：與建模前相比，建模成功的6只心肌攝取18F-FDG有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p<0.05；

圖4 心肌缺血大鼠心臟TTC染色圖Fig.4 The TTC staining picture of ischemical myocardical

圖5 正常大鼠心臟TTC染色圖Fig.5 The TTC staining picture of normal myocardical

4 小結(jié)

(1)雙示蹤劑13NH3·H2O和18F-FDG的Micro-PET顯像已經(jīng)是臨床評(píng)價(jià)心肌存活的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但此法用于臨床前動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)鮮有報(bào)道。本研究嘗試用此法評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物心肌缺血模型，為建立抗心肌缺血藥物開發(fā)的Micro-PET評(píng)價(jià)平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。

(2)與傳統(tǒng)的心電圖監(jiān)測(cè)方法相比，Micro-PET顯像技術(shù)可以從分子水平、功能代謝方面評(píng)價(jià)心肌缺血，大大提高了評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性；與TTC方法相比，Micro-PET顯像技術(shù)可實(shí)現(xiàn)連續(xù)、動(dòng)態(tài)、活體、無(wú)創(chuàng)成像。

綜上所述，13NH3·H2O 聯(lián)合18F-FDG Micro-PET顯像技術(shù)在評(píng)價(jià)心肌缺血模型具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。

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