楊德強(qiáng) 高 揚(yáng) 蔡國(guó)棟 周 磊 王 增 王俊勤 秦玉清

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016；2. 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000)

LDH是骨科中常見(jiàn)病、多發(fā)病，是引起腰腿痛最常見(jiàn)的原因之一,其確切病因目前尚無(wú)確切報(bào)道，但許多研究表明它與椎間盤的退變密切相關(guān)，因此從各個(gè)角度研究椎間盤的退變對(duì)于防治腰椎間盤突出顯得尤為重要。目前對(duì)于椎間盤突出后TNF-α對(duì)根性疼痛的研究比較多，而在椎間盤退變中的意義研究的較少。本實(shí)驗(yàn)以退變的椎間盤作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)腫瘤壞死因子及其受體定量表達(dá)和量值變化的研究，探討其在退變椎間盤組織中的表達(dá)及規(guī)律，與腰腿痛及根性坐骨神經(jīng)疼痛程度的關(guān)系，從免疫學(xué)和生物化學(xué)角度研究椎間盤退變的病因和病理機(jī)制，為扭轉(zhuǎn)和修復(fù)退變椎間盤組織提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有助于探尋抑制細(xì)胞凋亡人工合成細(xì)胞因子，期望延遲或阻斷這一病理過(guò)程。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象與分組

實(shí)驗(yàn)組：椎間盤標(biāo)本取自泰醫(yī)附院2011～2013年內(nèi)確診的LDH手術(shù)患者，每個(gè)標(biāo)本均包括髓核、纖維環(huán)和一部分軟骨終板。經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為退變的椎間盤組織，共40例，男25例，女15例。平均年齡42.5歲(最大者72歲，最小者18歲)：術(shù)中病理分型：脫垂游離型12例，突出型28例。

對(duì)照組：標(biāo)本取自外傷后致腰椎爆裂骨折手術(shù)患者，術(shù)前證實(shí)無(wú)腰椎疾患，病理學(xué)證實(shí)所取標(biāo)本為正常椎間盤組織，共搜集10例。男7例，女3例，年齡在17～45歲，平均年齡32.6歲。

1.2標(biāo)本的收集、存放、處理

對(duì)照組共10例，均取自腰椎爆裂骨折手術(shù)患者，病理學(xué)證實(shí)為正常椎間盤組織。實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本取自椎板切開(kāi)減壓髓核摘除術(shù)患者，術(shù)中盡可能完整摘除突出組織，并仔細(xì)分辨出椎間盤的不同部分。所有組織切除后30分鐘送到實(shí)驗(yàn)室，用生理鹽水反復(fù)沖洗3遍，洗凈上面的血液，用蔗糖進(jìn)行脫水后，放入-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3研究方法：

對(duì)所選取的標(biāo)本進(jìn)行分組：實(shí)驗(yàn)組40例，均為初次發(fā)病的腰椎間盤突出癥手術(shù)患者，年齡在18～60歲之間；對(duì)照組10例，取自無(wú)椎間盤突出癥因外傷至腰椎爆裂骨折需要椎管減壓手術(shù)患者，年齡20～40歲之間，選取標(biāo)本中含有不同比例的纖維核、髓核及少量的軟骨終板。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)TNF-α、TNF-β以及sTNFR1,sTNFR2的濃度；用逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒椒?RT-PCR)法檢測(cè)靶細(xì)胞膜表面TNFR1/R2mRNA的表達(dá)。然后用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)差和均數(shù)，分析總體差異和各組差異。并對(duì)實(shí)驗(yàn)組的TNF-α的含量與其臨床表現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行比較分析，并運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、處理

2 結(jié) 果

2.1組織TNF-α、TNF-β的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立(見(jiàn)圖1、圖2)。

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組TNFα/β含量檢測(cè)結(jié)果

注:對(duì)照組與突出型病例組比較，P<0.01；游離脫垂型病例組與對(duì)照組比較，P<0.01；突出型病例組與游離脫垂型病例組比較，P<0.01

2.2血漿sTNF-R1/R2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖3、圖4)。

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組血漿sTNF-R1/R2定量檢測(cè)結(jié)果

注：突出型病例組與對(duì)照組比較，P<0.01；游離脫乖型病例組與對(duì)照組比較，P<0.01；突出型病例組與游離脫垂型病例組比較，P<0.01

2.3 TNF-R1、TNF-R2的基因表達(dá)

2.3.1對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組椎間盤標(biāo)本RNA電泳圖(見(jiàn)圖5)

28S是18S條帶強(qiáng)度的兩倍，認(rèn)為RNA的質(zhì)量是好的。

2.3.2內(nèi)參照β-action和TNF-Rl/R2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

2.3.2.1內(nèi)參照β-action PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在不同循環(huán)數(shù)表達(dá)電泳圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖6、7)。

2.3.2.2TNF-R1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在不同循環(huán)數(shù)表達(dá)的電泳圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖8、9)。

2.3.2.3TNF-R2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在不同循環(huán)數(shù)表達(dá)的電泳圖(見(jiàn)圖10)。

2.3.3對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組TNF-R1/R2在椎間盤中的表達(dá)與水平。

2.3.3.1對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組TNF-R1/R2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在骨髓標(biāo)本中表達(dá)的電詠圖(見(jiàn)圖11)。

表3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組TNF-R1在骨髓中的表達(dá)水平的表達(dá)水平

注：突出型病例組與對(duì)照組比較，P<0.01，游離脫垂型病例組與對(duì)照組比較P<0.01；突出型病例組與游離脫垂型病例組比較，P<0.01。

圖10 TNF-R2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在不同循環(huán)數(shù)

3 討 論

目前研究認(rèn)為，LDH發(fā)生在椎間盤退變的基礎(chǔ)上，有機(jī)械負(fù)荷，炎癥刺激、自身免疫等綜合作用的結(jié)果。LDH是導(dǎo)致坐骨神經(jīng)痛最常見(jiàn)原因。突出后引起的坐骨神經(jīng)的放射痛是來(lái)源于神經(jīng)根電生理的異常放電，例如機(jī)械性壓迫、牽拉、和化學(xué)性因子刺激是導(dǎo)致這種異常放電的主要原因。在椎間盤突出、退變后可以合成和分泌許多種炎癥介質(zhì)[10]，它們共同加速了椎間盤退變的進(jìn)展。局部椎間盤的炎性因子刺激其相鄰的神經(jīng)根造成脊神經(jīng)根炎，從而引起其腰腿痛和神經(jīng)功能的變化。在眾多的細(xì)胞因子中腫瘤壞死因子大家族TNF-α含量的高低在某種程度上決定著疼痛的程度。

3.1TNF-α在IVDD和突出中的作用

本次試驗(yàn)證明，在椎間盤突出的標(biāo)本組織中檢測(cè)到TNF-α的含量較對(duì)照組明顯增多，利用統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果兩者具有明顯的差異性(P<0.01)。動(dòng)物試驗(yàn)也證實(shí)了在沒(méi)有外界壓迫的因素下髓核組織能引起神經(jīng)根和結(jié)構(gòu)上的不同。國(guó)內(nèi)外的學(xué)者也研究證實(shí)，在退變的椎間盤組織中存在較高的TNF-α，它可以促進(jìn)椎間盤組織I型膠原明顯合成的增加，并慢慢取代Ⅱ型膠原，進(jìn)一步發(fā)展成椎間盤的纖維化[11]。

3.1.1TNF-a對(duì)神經(jīng)根的直接影響

本試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)突出的椎間盤組織中含有大量的TNF-α，由TNF-α在退變椎間盤組織病理研究中，對(duì)其神經(jīng)根影響的研究相對(duì)較多，它與眾多炎性因子一起可引起神經(jīng)根炎，這是由于纖維環(huán)破裂、髓核液漏至椎間盤外并沿著神經(jīng)根擴(kuò)散引起神經(jīng)根炎癥的一種狀態(tài)。Ozaktay等在研究Sprague-Dawley大鼠中發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL- 1可以造成神經(jīng)末梢周圍及背神經(jīng)節(jié)的敏感性改變[12]，TNF-α的這一作用也支持了其作為下腰痛及坐骨神經(jīng)痛中炎癥反應(yīng)介質(zhì)這一觀點(diǎn)。目前已有研究發(fā)現(xiàn)在突出的椎間盤組織中所產(chǎn)生的前列腺素E2(PGE2)，可以刺激神經(jīng)根引起坐骨神經(jīng)痛。Kayama等的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α和髓核組織都可誘導(dǎo)髓鞘損傷，軸突的變型以及神經(jīng)傳導(dǎo)功能的喪失[13]。Miyamoto等研究證實(shí)在突出的椎間盤組織中不僅含有大量的TNF-α，還含有IL-1和環(huán)氧化酶-2(COX-2)、COX-2調(diào)節(jié)前列腺素的合成，而TNF-α又加速COX-2的合成，最終會(huì)極大地增加前列腺素的生成，導(dǎo)致疼痛持續(xù)加劇，可以引起神經(jīng)功能傳導(dǎo)的障礙，還可以聯(lián)合其它炎性介質(zhì)對(duì)神經(jīng)根造成繼發(fā)性的病理改變。

3.1.2TNF-a的間接作用

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)退變椎間盤組織中TNF-α的含量以及癥狀評(píng)分的相關(guān)因素，證實(shí)了兩者存在一定的相關(guān)性。對(duì)TNF-α而言，實(shí)驗(yàn)組椎間盤突出、脫出與對(duì)照組椎間盤完整者相比，差異具有顯著性的意義(P< 0.01 )。TNF-α在退變椎間盤組織中的生成越多，其致病的作用就越明顯，其臨床表現(xiàn)也就越重，這可能是通過(guò)受體的上調(diào)或者下調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)其局部炎癥反應(yīng)。所以腫瘤壞死因子對(duì)神經(jīng)根的致痛作用和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡作用與腫瘤壞死因子受體的數(shù)量以及sTNFR的含量相關(guān)聯(lián)。

在臨床上一部分患者通過(guò)影像學(xué)檢查證實(shí)了有巨大的椎間盤突出，但從其臨床體征和癥狀并不明顯，即使有少部分患者神經(jīng)根放射疼痛癥狀，服用一些非甾體類消炎止痛藥大多能緩解，說(shuō)明這類患者的椎間盤退變產(chǎn)生的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)在起一定的作用，并沒(méi)有對(duì)神經(jīng)根造成壓迫。所以有突出不一定產(chǎn)生疼痛，但有疼痛一定有炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的參與。本次試驗(yàn)通過(guò)對(duì)患病組和對(duì)照組中髓核和纖維核中腫瘤壞死因子濃度的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩者存在明顯的差異。即實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組TNFα/β有較高的表達(dá)率(P<0.01)，說(shuō)明腫瘤壞死因子及其受體與腰椎間盤的退變和患者的腰腿痛的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。術(shù)后患者的神經(jīng)根壓迫得以緩解，但仍然有神經(jīng)根源性疼痛，服用非甾體類消炎藥后癥狀有所減輕也說(shuō)明了炎癥介質(zhì)參與了椎間盤退變的全過(guò)程。應(yīng)用藥后可能是減輕了局部神經(jīng)根的刺激，或者減少了腫瘤壞死用因子的啟動(dòng)或數(shù)量，下調(diào)了及其受體的數(shù)量，不過(guò)這一結(jié)論還需要進(jìn)一步的研究。這一推論為退變的椎間盤逆轉(zhuǎn)和修復(fù)提供了可行的分析，為以后尋找抑制椎間盤細(xì)胞凋亡的人工合成因子提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2腫瘤壞死因子受體在椎間盤退變和坐骨神經(jīng)疼痛中的作用

研究表明TNFR1是腫瘤壞死因子的主要受體，TNFRl是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的優(yōu)勢(shì)受體，在椎間盤退變的細(xì)胞中有較高的表達(dá)率。本次實(shí)驗(yàn)中患病組中的TNFR1明顯高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組患者的坐骨神經(jīng)疼痛的癥狀與其檢測(cè)到的腫瘤壞死因子受體表達(dá)高低呈正相關(guān)，腫瘤壞死因子受體的上調(diào)或者下調(diào)決定了腫瘤壞死因子的表達(dá)高低，這種上調(diào)反作用于椎間盤的髓核、纖維核，以及軟骨終板，使椎間盤進(jìn)行的加速退變，纖維環(huán)破裂，髓核向后方突出，刺激或者壓迫脊神經(jīng)或脊髓引起患者坐骨神經(jīng)的癥狀。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立腫瘤壞死因子及其受體的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)理方法，定量檢測(cè)出了TNF-α/TNF-β以及sTNFRl/R2的含量。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)出靶細(xì)胞膜表面腫瘤壞死因子受體(TNFRl/R2mRNA)的表達(dá)。 通過(guò)組間t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組中TNF-α/TNF-β、TNFR、sTNFRS的含量明顯高于對(duì)照組，提示著這些物質(zhì)參與了椎間盤退變的進(jìn)程。 TNF、TNFR、sTNFRS三者之間存在一定的相關(guān)性(P<0.05)，不是孤立存在的，三者之間在細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的作用下相互作用，密切聯(lián)系。

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