方 念 方紫凌 張慧卿 韓小妮 黃 根 王農(nóng)榮 熊建萍 張焜和

甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），作為血清標(biāo)記物已廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的臨床診斷、治療及預(yù)后判斷［1］。近年研究表明，AFP在HCC的細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用［2-3］。Survivin是近年發(fā)現(xiàn)的凋亡蛋白抑制因子家族成員，其最顯著的特點(diǎn)是僅在各種腫瘤中表達(dá)，而在正常分化組織中沉默，是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一［4］。研究表明，肝癌組織中Survivin呈高表達(dá)狀態(tài)，是獨(dú)立的預(yù)后不良因素［5］。目前，肝癌細(xì)胞AFP與Survivin之間調(diào)控關(guān)系的研究，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究以肝癌細(xì)胞HepG2為研究對(duì)象，通過RNA干擾技術(shù)沉默AFP，檢測(cè)細(xì)胞凋亡和Survivin基因表達(dá)的變化，以探討肝癌AFP基因靶向RNA干擾治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國GibcoBR公司；胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供；Lipofectami-neTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國綠陽公司；AFP定量測(cè)定試劑盒（ELISA）由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供；AFP基因的RNA干擾系列和相關(guān)引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)與合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞由南昌大學(xué)消化研究所惠贈(zèng)，將細(xì)胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，接種于37℃，5%CO2，飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 本研究實(shí)驗(yàn)細(xì)胞共分為3組，即實(shí)驗(yàn)組、脂質(zhì)體+空質(zhì)粒對(duì)照組和空白組。

1.2.3 ELISA法測(cè)定HepG2細(xì)胞上清液AFP 接種培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，分別收集轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后12、24、48 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 000 rpm，4℃離心10 min，取上清液。按照試劑盒說明書操作，采用ELISA法檢測(cè)AFP含量。

1.2.4 siRNA沉默HepG2細(xì)胞AFP基因 1）本研究選取的AFP siRNA目的基因片段：5'-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3'，送上海生工設(shè)計(jì)、合成干擾系列和引物。上游引物系列：5'-AAA TAC ATC CAG GAG AGC CA-3'，下游引物系列：5'-CTG AGC TTG GCA CAG ATC CT-3。2）構(gòu)建載體：參照亓同鋼等［6］報(bào)道的方法構(gòu)建AFP基因siRNA表達(dá)質(zhì)粒。3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，用不含血清、抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸。每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，加質(zhì)粒和經(jīng)稀釋的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育4 h，于12 h和24 h更換培養(yǎng)基，48h收獲細(xì)胞。

1.2.5 細(xì)胞增殖與凋亡的檢測(cè) 1）MTT法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖：收集轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后12、24、36、48 h的HepG2細(xì)胞，每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL，每孔內(nèi)加入20 μL MTT溶液（3 g/L），將細(xì)胞移入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6h。吸去培養(yǎng)基，每孔內(nèi)加入150 μL DMSO，振蕩搖勻，用酶標(biāo)儀于490 nm波長條件下測(cè)定吸光度值。2）AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡：收集轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后12、24、48 h HepG2細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化、收集總細(xì)胞，PBS洗滌2次，棄上清。加入400 μL結(jié)合緩沖液使細(xì)胞重懸，再加6 μL Annexin V-FITC，4 μL PI，室溫避光孵育15 min。采用激發(fā)波長488 nm，分別以紅色和綠色熒光通道檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測(cè)Survivin基因 采用RT-PCR半定量檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染前后Survivin基因的表達(dá)，收集各組轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后12、24、48 h的HepG2細(xì)胞，以合成的Survivin基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物系列：5'-CCG CAT ACA GTG GTC GAG AGA-3'，下游引物系列：5'-GTG TAG GGT GTA GAA TCC TGT TCA-3'。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞上清液AFP水平

采用ELISA法檢測(cè)HepG2細(xì)胞上清液AFP濃度，所得結(jié)果（表1）。

表1 轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AFP的濃度（ng/mL）Table1 AFP level in the supernatant of hepatocellular carcinoma HepG2 cells

2.2 AFP siRNA轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞生長活力下降

收集經(jīng)轉(zhuǎn)染后12、24、36、48 h的HepG2細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24 h和48 h后轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組間有顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 MTT檢測(cè)AFP siRNA轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞增殖Figure1 Effects of AFP siRNA on HepG2 cell proliferation detected by MTT assay

2.3 AFP siRNA轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞凋亡增加

本研究檢測(cè)了轉(zhuǎn)染AFP-siRNA 48 h后，各組HepG2細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組AFP-siRNA的細(xì)胞凋亡率為35.6%，較轉(zhuǎn)染前增加了24.3%。陰性對(duì)照組和空白組細(xì)胞凋亡率分別為12.5%和11.3%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

2.4 HepG2細(xì)胞AFP siRNA對(duì)Surivivin基因表達(dá)的影響

收集12、24和48 h后轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞，經(jīng)基因擴(kuò)增，UV凝膠圖像分析儀分析電泳結(jié)果，AFP-siRNA轉(zhuǎn)染24、48 h后Survivin mRNA較轉(zhuǎn)染前減少59%、78%。HepG2細(xì)胞上清液AFP水平與HepG2細(xì)胞Survivin-mRNA表達(dá)的變化具有較強(qiáng)的一致性（圖3）。

圖2 轉(zhuǎn)染AFP-siRNA-48 h后HepG2細(xì)胞凋亡率Figure2 Effects of AFP siRNA on HepG2 cell apoptosis

圖3 AFP-siRNA轉(zhuǎn)染后AFP和Survivin mRNA表達(dá)的變化Figure3 Changes in AFP and Survivin mRNA expression after AFP-siRNA silence

3 討論

由于大量慢性乙型肝炎感染人群的存在，原發(fā)性肝癌仍是我國高發(fā)的重大疾?。?］。近年來，肝癌的治療效果有所提高，其主要原因之一是以AFP為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)以及結(jié)合現(xiàn)代影像技術(shù)的進(jìn)步，提高了肝癌的早期診斷率，進(jìn)而提高了肝癌患者的早期處理比例［8］。AFP廣泛應(yīng)用于HCC的診斷、監(jiān)測(cè)和隨訪，但其生物學(xué)功能直到近來才引起人們注意。大量研究證實(shí)，AFP具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，如促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、抑制凋亡和免疫逃避［2，9］。

本研究通過小RNA干擾技術(shù)沉默肝癌HepG2細(xì)胞中AFP基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染48 h后，肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AFP的濃度明顯下降［由（988.45±12.58）ng/mL降至（154.23±7.78）ng/mL］，與對(duì)照組相比有顯著差異，提示轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞生長被抑制43.04%，而細(xì)胞凋亡率則增加24.3%，即沉默肝癌細(xì)胞AFP基因的表達(dá)后，細(xì)胞增殖降低，細(xì)胞凋亡增加，這與Yang等［3］報(bào)道的結(jié)果相似。

Survivin是一種凋亡抑制蛋白（inhibition apoptosis protein，IAP），在除甲狀腺、胸腺及生殖腺以外的分化成熟的成人組織中表達(dá)缺失，而在絕大多數(shù)腫瘤組織中表達(dá)陽性，這種表達(dá)特性使其迅速成為惡性腫瘤診斷與治療研究的新靶點(diǎn)。研究表明，Survivin在肝癌細(xì)胞高表達(dá)，調(diào)控著細(xì)胞的分裂、增殖和凋亡［10-11］。

如前所述，我們通過RNA干擾下調(diào)肝癌HepG2細(xì)胞AFP基因表達(dá)之后，肝癌細(xì)胞的凋亡率增加。本研究還觀察到在轉(zhuǎn)染的過程中，隨著培養(yǎng)上清液AFP濃度的持續(xù)下降，Survivin mRNA的水平也逐漸降低，兩者表現(xiàn)出較好的一致性。因此，我們推測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化可能與Survivin的表達(dá)下降相關(guān)，即沉默AFP基因能抑制Survivin表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)凋亡。與我們的報(bào)道相符，Li等［12］在Bel7402細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，通過AFP抗體抑制AFP的表達(dá)后Survivin水平明顯降低，肝癌細(xì)胞凋亡效果加強(qiáng)，同時(shí)認(rèn)為AFP通過上調(diào)Survivin的表達(dá)來抑制TRAIL誘導(dǎo)凋亡的活性。

AFP在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，通過本研究表明，通過RNA干擾技術(shù)阻斷AFP表達(dá)，對(duì)于控制AFP陽性HCC的發(fā)展及術(shù)后復(fù)發(fā)可能具有重要價(jià)值。

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