凌桂琴 陳冬波 王保慶

乳腺癌目前仍然是女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性腫瘤的23%，其死亡率僅次于肺癌位居第二。美國癌癥協(xié)會預(yù)計(jì)2013年僅美國將有23萬多患者被診斷為乳腺癌，4萬多患者死于乳腺癌［1］。隨著我國生活水平的提高及家庭人口簡單化，乳腺癌發(fā)生率呈持續(xù)上升趨勢，且與西方發(fā)達(dá)國家相比，中位發(fā)病年齡提前10～15年，已經(jīng)嚴(yán)重威脅婦女的身心健康［2］。

近年的研究表明他汀類藥物（statins）除了具有競爭性抑制3-羥-3甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶降低血清膽固醇治療高膽固醇血癥功能之外，還能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤內(nèi)血管生成等作用。文獻(xiàn)報(bào)道他汀類藥物包括洛伐他汀、辛伐他?。╯imvastatin，SIM）、阿發(fā)他汀及普伐他汀等對結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌等腫瘤顯示出較好的療效［3］。已有研究證實(shí)SIM能抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4-5］。本組以前的研究表明乳腺癌MCF-7細(xì)胞高水平的表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物Oct3/4、Nanog和Sox-2［6］。因此，本研究選用SIM處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，探討SIM對MCF-7細(xì)胞內(nèi)多能干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

MCF-7細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物所，DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購自Gibco公司。二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和SIM均購自Sigma公司。RNA提取試劑盒購自GIAGEN，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司，目的基因和內(nèi)參基因的引物和探針混合物均購自Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12的培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR） 將MCF-7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×106個細(xì)胞數(shù)接種于10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液加SIM，SIM濃度分別為0、1、10、50、100 μmol/L，培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞，按照試劑盒說明提取RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系20 μL，然后進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為30 μL，以無菌純H2O代替DNA模板作為陰性對照。PCR反應(yīng)混合物包括：2×PCR Master Mix 15 μL，20×引物和探針混合物1.5 μL，cDNA模板3 μL，其余用無菌水補(bǔ)足。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃預(yù)變性 10 min，95℃15 s，60℃1 min 40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。反應(yīng)在Eppendorf realplex2熒光定量PCR分析儀上進(jìn)行。各基因 相 關(guān) 信 息 為 ：Oct3/4（Hs01895061_u1），Nanog（Hs02387400_g1），Sox-2（Hs01053049_s1），GAPDH（4352934E）。每個基因均建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始拷貝數(shù)，目的基因的定量表達(dá)通過與內(nèi)參基因GAPDH比較進(jìn)行分析。

1.2.3 免疫熒光染色 將MCF-7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×104細(xì)胞數(shù)接種于24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液加SIM，SIM濃度分別為0和10 μmol/L，培養(yǎng)48 h后用BD公司的Cytofix/Cytoperm固定液固定細(xì)胞，猴血清封閉20 min后，一抗4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，二抗為羅丹明紅標(biāo)記的熒光抗體。一抗分別為：羊抗Oct3/4抗體（1∶200，sc-8628），Santa Cruz生物技術(shù)公司提供，鼠抗Sox-2抗體（1∶100，MAB 4343），Millipore生物技術(shù)公司提供，Nanog抗體為甲硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的抗體，由NeoBioscience公司提供，1：50直接染色觀察。Olympus1×51熒光顯微鏡拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測 將MCF-7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×104細(xì)胞數(shù)接種于24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液加SIM，SIM濃度分別為0和10 μmol/L，培養(yǎng)48 h后用BD公司的Cytofix/Cytoperm固定液固定細(xì)胞，Oct3/4陽性細(xì)胞的定量染色為：羊抗Oct3/4抗體（1∶50）4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，二抗為藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的抗體（1∶50，Santa Cruz公司）。Nanog陽性細(xì)胞的定量染色為直接染色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗體1∶25 4℃孵育30 min。Sox-2陽性細(xì)胞的定量染色為：鼠抗Sox-2抗體（1∶50），4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，二抗為PE標(biāo)記的抗體。對照組用相應(yīng)的熒光標(biāo)記的同型對照抗體染色。BD FACSC流式細(xì)胞儀（BD公司）檢測，Weasel軟件分析結(jié)果。

1.2.5 Western Blot定量分析 將MCF-7細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×104細(xì)胞數(shù)接種于24孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液加SIM，SIM濃度分別為0和10 μmol/L，培養(yǎng)48 h后用RIPA細(xì)胞裂解液（南京生興生物技術(shù)有限公司）處理，BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，細(xì)胞裂解物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，用硝化纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)（美國BioRad公司）轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行免疫印跡，5%脫脂奶粉封閉2 h，羊抗Oct3/4抗體（1∶500），鼠抗Nanog（1∶200，sc-33759，SantaCruz公司）抗體，鼠抗Sox-2抗體（1∶500）及內(nèi)參基因GAPDH抗體（1∶5 000，SantaCruz公司）4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育1h后，用ECL超敏化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，所用其它試劑均由萊茲生物科技有限公司提供。Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SIM對MCF-7細(xì)胞內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2基因表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，10、50、100 μmol/L SIM作用于MCF-7細(xì)胞48h后，能顯著地抑制細(xì)胞內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2基因表達(dá)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而SIM 1 μmol/L濃度組和對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但是SIM抑制Oct3/4、Nanog和Sox-2基因的作用不是隨著劑量的增加而增大。SIM 50、100 μmol/L濃度組與10 μmol/L濃度組相比，Oct3/4和Nanog的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Sox-2的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），SIM 50 μmol/L濃度組和100 μmol/L濃度組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1，圖1）。

表1 SIM對MCF-7細(xì)胞內(nèi)Oct3/4，Nanog，和Sox-2 mRNA表達(dá)的影響 （±s）Table1 Effects of simvastatin on gene expression of Oct3/4,Nanog,and Sox-2 in MCF-7 cells

表1 SIM對MCF-7細(xì)胞內(nèi)Oct3/4，Nanog，和Sox-2 mRNA表達(dá)的影響 （±s）Table1 Effects of simvastatin on gene expression of Oct3/4,Nanog,and Sox-2 in MCF-7 cells

a:P＜0.05,experimental group vs.control;b:P＜0.05,experimental group vs.SIM 1 μmol/L;c:P＜0.05,experimental group vs.SIM 10 μmol/L

Groups Control 1 μmol/L 10 μmol/L 50 μmol/L 100 μmol/L Samples 3 3 3 3 3 Oct3/4 mRNA 1.725±0.206 1.875±0.203 1.202±0.183ab 0.810±0.100abc 0.860±0.108abc Nanog mRNA 2.074±0.196 1.87±0.094 1.506±0.156ab 1.184±0.110abc 1.079±0.140abc Sox-2 mRNA 0.938±0.139 1.065±0.208 0.670±0.059ab 0.682±0.106ab 0.605±0.200ab

2.2 SIM對MCF-7細(xì)胞內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2表達(dá)的影響

免疫熒光染色結(jié)果顯示，對照組多能干細(xì)胞標(biāo)志物Oct3/4、Nanog和Sox-2表達(dá)在MCF-7細(xì)胞核內(nèi)，Oct3/4（圖2A）和Sox-2（圖2C）為強(qiáng)紅色熒光，Nanog為綠色熒光（圖2E），而經(jīng)10 μmol/L SIM處理48 h后，MCF細(xì)胞核內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)熒光減弱，部分細(xì)胞核無表達(dá)（圖1B，D，F(xiàn)）。

2.3 Oct3/4陽性細(xì)胞數(shù)、Nanog陽性細(xì)胞數(shù)和Sox-2陽性細(xì)胞數(shù)的變化

圖3顯示MCF-7細(xì)胞經(jīng)10 μmol/L SIM處理48 h后，Oct3/4陽性細(xì)胞數(shù)由（4.25±1.03）%減少到（0.96±0.24）%，Nanog陽性細(xì)胞數(shù)由（4.39±0.87）%減少到（0.76±0.21）%，Sox-2陽性細(xì)胞數(shù)有（6.73±2.04）%減少到（1.47±0.58）%，統(tǒng)計(jì)分析差異均有顯著性（P＜0.05）。

2.4 SIM對MCF-7細(xì)胞內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，SIM處理48 h后，MCF-7細(xì)胞內(nèi)多能干細(xì)胞標(biāo)志物Oct3/4、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)均減少（圖4A），通過與內(nèi)參基因GAPDH比較，Image J軟件分析顯示條帶的灰度有顯著性差異（P＜0.05，圖4B）。

圖1 SIM 對MCF-7細(xì)胞內(nèi)Oct3/4，Nanog，和Sox-2 mRNA表達(dá)的影響Figure1 Effects of simvastatin on gene expression of Oct3/4,Nanog,and Sox-2 in MCF-7 cells

圖2 SIM作用48 h后對MCF-7細(xì)胞內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2表達(dá)的影響（×400）Figure2 Expression of Oct3/4(A,B),Nanog(C,D),and Sox-2(E,F)in MCF-7 cells treated with 10 μmol/L SIM.A,C,E：control group;B,D,F：treatment group

圖3 MCF-7細(xì)胞經(jīng)SIM處理48h后Oct3/4陽性細(xì)胞數(shù)、Nanog陽性細(xì)胞數(shù)和Sox-2陽性細(xì)胞數(shù)的變化Figure3 Oct3/4-positive cells(A,B),Nanog-positive cells(C,D),and Sox-2-positive cells(E,F)were significantly reduced by 10 μmol/L SIM treatment for 48 h(P＜0.05)

3 討論

越來越多的研究支持乳腺癌起源于乳腺癌腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）和/或祖細(xì)胞的觀點(diǎn)。乳腺癌腫瘤干細(xì)胞是存在于乳腺中具有自我更新和分化能力的一小群細(xì)胞，與正常胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）類似但具有異常的自我更新通路［7］。研究表明乳腺癌腫瘤干細(xì)胞也是乳腺癌形成、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥的源泉［8-9］。因此，針對乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的治療能為耐藥的乳腺癌預(yù)防和治療提供有前途的治療方法。

圖4 SIM作用48小時后對MCF-7細(xì)胞內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)的影響Figure4 Western blot analysis for Oct3/4,Nanog,and Sox-2 expression in MCF-7 cells treated with 10 μmol/L SIM(A).Quantitative assessment of protein expression showed significantly reduced expressions of Oct3/4,Nanog,and Sox-2 in MCF cells treated with 10 μmol/L SIM compared with the controls(P＜0.05)(B)

他汀類藥物（statins）由于抑制膽固醇合成限速酶HMG-CoA還原酶，阻斷甲羥戊酸通路，從而抑制內(nèi)源性膽固醇的合成而降低血膽固醇，目前已成為臨床上治療高膽固醇血癥的主要藥物。近年的研究表明，他汀類藥物除降血脂的作用外，還具有改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用、神經(jīng)保護(hù)、促進(jìn)骨代謝、改善慢性腎病的進(jìn)展以及抗腫瘤等多種功能［10-11］。許多體外和臨床前試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，多種他汀類藥物尤其是脂溶性的例如SIM對包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌癥細(xì)胞，通過多渠道發(fā)揮抗腫瘤作用：抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗血管生成、降低腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力、放療增敏作用及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與分化［12-14］。Sánchez等［5］人研究報(bào)道SIM抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期停止而引起的細(xì)胞凋亡有關(guān)。Gopalan等［12］報(bào)道SIM聯(lián)合生育三烯酚能清除耐藥MCF-7細(xì)胞中乳腺癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞。但SIM對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)多能干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響未見報(bào)道。

本研究采用實(shí)時qRT-PCR技術(shù)、免疫熒光染色、流式細(xì)胞分析以及Western blot方法檢測SIM對乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)多能干細(xì)胞標(biāo)志物Oct3/4、Nanog和Sox-2表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明10、50和100 μmol/L SIM作用于MCF-7細(xì)胞48 h后，能顯著地抑制細(xì)胞內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2基因表達(dá)，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SIM 50、100 μmol/L濃度組和10 μmol/L濃度組相比，抑制Oct3/4和Nanog的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對Sox-2的表達(dá)抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SIM 50 μmol/L濃度組和100 μmol/L濃度組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明SIM能抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)多能干細(xì)胞標(biāo)志物Oct3/4、Nanog和Sox-2基因的表達(dá)，但其作用并非隨著濃度的增加而逐漸加大。免疫熒光染色顯示經(jīng)10 μmol/L SIM處理48 h后MCF-7細(xì)胞核內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)熒光減弱，部分細(xì)胞核呈現(xiàn)無表達(dá)，Westernblot進(jìn)一步證實(shí)10 μmol/L SIM處理48 h后MCF-7細(xì)胞核內(nèi)Oct3/4、Nanog和Sox-2蛋白表達(dá)顯著減少，表明SIM也能抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)多能干細(xì)胞標(biāo)志物Oct3/4、Nanog和Sox-2蛋白的表達(dá)。Oct3/4、Nanog和Sox-2是首先在ESCs細(xì)胞中明確的維持干細(xì)胞多潛能性和自我更新的重要調(diào)控因子，廣泛用作ESCs細(xì)胞多潛能性鑒定的標(biāo)志分子［15］。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞內(nèi)多能干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，是SIM抗腫瘤的另一可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用他汀類藥物作為抗癌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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