傅應(yīng)亞 韓曉黎 黎友倫

肺癌是絕大多數(shù)國(guó)家惡性腫瘤死亡的首要原因。肺癌中約80%為非小細(xì)胞肺癌，病死率高。順鉑是目前肺癌化療的一線推薦藥物，其抗腫瘤作用已得到肯定，但極易形成耐藥，故限制了它的應(yīng)用。因此，如何提高化療敏感性、減少耐藥以提高療效、延長(zhǎng)患者生存期已成為近年來(lái)肺癌臨床治療急需解決的問(wèn)題之一。

細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少是肺癌順鉑耐藥分子機(jī)制之一。肺耐藥蛋白（lung resistance protein，LRP）是Scheper等［1］在P-gp（p-糖蛋白）陰性的多藥耐藥性肺癌細(xì)胞系SW-1573/2R 120中發(fā)現(xiàn)的一種高表達(dá)的蛋白。LRP是一種穹窿體蛋白（major vault protein，MVP），主要存在于核膜和胞漿囊泡，參與藥物進(jìn)出胞核及囊泡運(yùn)輸。因此，LRP通過(guò)阻止藥物進(jìn)入胞核，把胞漿的藥物運(yùn)入囊泡，通過(guò)胞吐作用排出，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少，誘導(dǎo)耐藥。研究發(fā)現(xiàn)，LRP在肺癌組織中高表達(dá)，且與肺癌細(xì)胞分型、吸煙、化療耐藥等有關(guān)［2］。用順鉑、阿霉素、博萊霉素分別短期處理肺癌細(xì)胞株，均可使細(xì)胞LRP mRNA表達(dá)增高，而僅順鉑的化療反應(yīng)性和LRP mRNA表達(dá)水平之間存在顯著相關(guān)性。Osborn等［3］認(rèn)為JNK信號(hào)通路是細(xì)胞應(yīng)答抗癌藥物的重要組成成分，可能在化療耐藥中起著重要的作用。Levresse等［4］研究發(fā)現(xiàn)鉑類藥物可促使JNK持續(xù)活化及下游c-jun的表達(dá)，從而減少藥物引起的凋亡，抑制JNK的活化可以增加小細(xì)胞肺癌的藥物敏感性。

由此可知，抑制JNK的活化可增強(qiáng)肺癌化療敏感性，而LRP的高表達(dá)與化療耐藥密切相關(guān)，因此，本實(shí)驗(yàn)擬用JNK信號(hào)通路特異性抑制劑SP600125抑制該通路，檢測(cè)其對(duì)LRP的影響，初步探討兩者的關(guān)系及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞A549來(lái)自重慶醫(yī)科大學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)，RPMI-1640購(gòu)自Gibco公司（GrandIsland，NY，USA），胎牛血清購(gòu)自四季青（浙江天杭生物科技有限公司），青鏈霉素混合液購(gòu)自Hyclone公司（Logan，UT，USA），0.25%含EDTA的胰酶購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自中國(guó)廣州奕源生物科技有限公司，順鉑購(gòu)自Sigma公司（St.Louis，MO，批號(hào)：p4394-25mg），SP600125購(gòu)自Sigma公司（St.Louis，MO，批號(hào)：s5567-10mg），BCA工作液購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司（Waltham，MA），BeyoEcl plus化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗JNK1/2、P-JNK1/2購(gòu)自abcam公司（Cambridge，UK），鼠抗LRP購(gòu)自SANTA CRUZ公司（CA，USA），兔抗GAPDH購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，放于37℃，5%CO2濕潤(rùn)的恒溫孵箱中，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，每隔2～3 d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)瓶的70%～80%時(shí)，用0.25%含EDTA的胰酶消化、傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用 A549細(xì)胞分為2組，順鉑單藥組及順鉑+SP600125組。順鉑單藥組設(shè)置藥物濃度梯度（0、1、2、4、8、16 μg/mL），順鉑+SP600125組先用SP600125（4 μg/mL）預(yù)處理1 h后再加入上述不同濃度的順鉑處理72 h。主要步驟：選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，加入藥物，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，處理72 h，加入10%CCK-8溶液，放入37℃，5%CO2濕潤(rùn)的恒溫孵箱中1.5 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，波長(zhǎng)為450 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用下述公式計(jì)算抑制率：抑制率（%）=（對(duì)照組-處理組）/（對(duì)照組-空白組）×100%。用中效方程式計(jì)算IC50。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞分為4組：對(duì)照組、順鉑組（16 μg/mL）、順鉑組（16 μg/mL）+SP600125（2 μ g/mL）組 、順 鉑 組（16 μ g/mL）+SP600125（4 μg/mL）組。后兩組先用SP600125預(yù)處理1 h，再加入順鉑。細(xì)胞按上述處理后，每組收集1×106個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，加入1 mL PBS制成單細(xì)胞懸液，按Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) A549細(xì)胞分兩批處理，均分為4組，第一批：對(duì)照組、順鉑2 μg/mL組、順鉑8 μg/mL組、順鉑16 μg/mL組；第二批：對(duì)照組、順鉑組（16 μg/mL）、順鉑組（16 μg/mL）+SP600125（2 μg/mL）組、順鉑組（16 μg/mL）+SP600125（4 μg/mL）組。檢測(cè)各處理組細(xì)胞中JNK、P-JNK、LRP的表達(dá)，內(nèi)參為GAPDH蛋白。主要步驟：細(xì)胞株處理、蛋白提取、電泳及轉(zhuǎn)膜，孵一抗、二抗，顯影。用Quantity One軟件分析各條帶吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 順鉑單藥對(duì)LRP表達(dá)的影響

用不同濃度順鉑作用于A549細(xì)胞72 h，然后提取總蛋白，用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中LRP的表達(dá)量。隨著順鉑濃度的增加，LRP的表達(dá)量增加，其中在8 μg/mL時(shí)LRP表達(dá)量最高，而達(dá)16 μg/mL時(shí)其表達(dá)量略有下降。8 μg/mL、16 μg/mL組與對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 順鉑單藥對(duì)JNK、P-JNK蛋白表達(dá)的影響

用不同濃度順鉑作用于A549細(xì)胞72 h，后提取蛋白，用Western blot法檢測(cè)JNK、P-JNK的表達(dá)情況。隨著順鉑濃度增加，P-JNK表達(dá)增多，其中在16 μg/mL時(shí)表達(dá)最多。而JNK總蛋白無(wú)明顯變化（圖2a）。

2.3 SP600125預(yù)處理的A549細(xì)胞JNK、P-JNK的變化情況

SP600125為JNK信號(hào)通路的特異性抑制劑，A549細(xì)胞先用不同濃度SP600125預(yù)處理1 h，然后加入16 μg/mL順鉑作用72 h后提取蛋白。用Western blot法檢測(cè)JNK、P-JNK蛋白的變化情況。隨著SP600125濃度增加，P-JNK表達(dá)水平逐漸降低，在4 μg/mL時(shí)P-JNK明顯被抑制（圖2b）。

2.4 SP600125預(yù)處理的A549細(xì)胞中LRP的變化情況

由Western blot的結(jié)果可知，用SP600125預(yù)處理的A549細(xì)胞，LRP表達(dá)水平較順鉑單藥處理組低（P＜0.05），且SP600125濃度越高，LRP表達(dá)水平越低（P＜0.05，圖3）。

圖1 不同濃度順鉑對(duì)A549細(xì)胞LRP表達(dá)的影響Figure1 Effect of CDDP on the LRP mRNA expression in A549 cells

圖2 不同濃度順鉑對(duì)A549細(xì)胞LRP表達(dá)的影響Figure2.Effect of CDDP on LRP expression in A549 cells

2.5 順鉑及SP600125聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，順鉑聯(lián)合SP600125組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于順鉑單藥組。用中效方程式計(jì)算的半數(shù)抑制濃度IC50。順鉑單藥組IC50為9.41。SP600125+CDDP組，即先用SP600129（4 μg/mL）預(yù)處理1 h，再加入不同濃度的順鉑處理72 h。經(jīng)之前的實(shí)驗(yàn)顯示，4 μg/mL的SP600125可阻斷JNK信號(hào)通路的磷酸化，但該濃度對(duì)A549細(xì)胞幾乎無(wú)毒性作用（圖4）。SP600125+CDDP組IC50為6.54，較順鉑單藥組明顯降低。由以上結(jié)果可知，用SP600125預(yù)處理的A549細(xì)胞，對(duì)順鉑的敏感性增加。

圖3 用SP600125預(yù)處理的A549細(xì)胞，LRP的變化情況Figure3 Effect of SP600125 on LRP expression in A549 cells.

圖4 順鉑及SP600125聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。與對(duì)照組比較，順鉑組除 1 μg/mL外，余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)；SP600125+CDDP組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)Figure4 Cell inhibition of CDDP or CDDP combined with SP600125(SP+CDDP)in A549 cells.Significant differences were found between the CDDP and SP+CDDP groups,except for the 1 μg/mL CDDP group(P＜0.05)

2.6 細(xì)胞凋亡率的變化

按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組，其中SP600125（2 μg/mL）+順鉑組（16 μg/mL）、SP600125（4 μg/mL）+順鉑組（16 μg/mL）分別用相應(yīng)濃度的SP600125預(yù)處理1 h，然后加入16 μg/mL的順鉑處理72 h，收集細(xì)胞，用Annexin V-PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示：順鉑組（16 μ g/mL）細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05），SP600125（2 μg/mL）+順鉑組（16 μg/mL）高于順鉑組（P＜0.05），而SP600125（4 μg/mL）+順鉑組（16 μg/mL）高于 SP600125（2 μg/mL）+順鉑組（16 μg/mL）（P＜0.05）。由此我們得出結(jié)論，用SP600125預(yù)處理的A549細(xì)胞可增強(qiáng)順鉑促凋亡的作用，且隨著SP600125濃度的增加其促凋亡的作用增加（圖5，表1）。

圖5 不同處理組A549細(xì)胞凋亡的情況Figure5 Effect of the JNK inhibitor on the CDDP-induced apoptosis in A549 cells

表1 SP600125預(yù)處理后順鉑對(duì)A549細(xì)胞凋亡情況Table1 Effect of the c-Jun N-terminal kinase(JNK)inhibitor on the CDDP-induced apoptosis in A549 cells

3 討論

細(xì)胞凋亡的起始及完成需要細(xì)胞內(nèi)外死亡通路的激活，然而多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路則調(diào)控著凋亡的過(guò)程，其中包括JNK信號(hào)通路［5］。JNK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated-protein kinase，MAPK）家族主要成員之一，大量實(shí)驗(yàn)提示JNK信號(hào)通路在細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和應(yīng)激反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。但對(duì)于其在細(xì)胞凋亡及耐藥中的作用尚存在爭(zhēng)議。

一方面，JNK信號(hào)通路的活化促進(jìn)細(xì)胞增殖、化療耐藥。Nateri等［6］研究發(fā)現(xiàn)敲除c-Jun基因或者特異性的使c-jun失活，可使小鼠腸道腫瘤變小，延長(zhǎng)小鼠的壽命。Kuntzen等［7］利用SP600125和siRNA抑制JNK的活性，發(fā)現(xiàn)可以增強(qiáng)CD95介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞周期阻滯。Cripe等［8］在對(duì)阿霉素耐藥的白血病細(xì)胞株HL-60/ADR中發(fā)現(xiàn)JNK的持續(xù)激活和c-jun的過(guò)度表達(dá)與耐藥性存在正相關(guān)，抑制JNK的活性可以降低多藥耐藥相關(guān)蛋白1的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。Levresse等［9］發(fā)現(xiàn)鉑類藥物可使JNK持續(xù)活化和促進(jìn)下游c-jun的表達(dá)，從而減少藥物引起的凋亡，抑制JNK的活化可以增加小細(xì)胞肺癌的藥物敏感性。李大衛(wèi)等［10］發(fā)現(xiàn)在胃癌SGC7901和SGC7901/DDP中，用SP600125阻滯JNK信號(hào)通路，可增強(qiáng)該兩種細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性，伴P-gp的表達(dá)明顯減低，說(shuō)明了抑制JNK信號(hào)通路可能是通過(guò)降低P-gp的表達(dá)逆轉(zhuǎn)該胃癌細(xì)胞株順鉑的耐藥。

另一方面，JNK信號(hào)通路的活化促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Mansouri等［11］在對(duì)順鉑敏感的卵巢癌細(xì)胞株中，順鉑可持續(xù)激活JNK，并引起其下游c-jun的過(guò)度磷酸化，形成轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1，上調(diào)死亡配體FasL的表達(dá)，從而引起細(xì)胞凋亡。Li等［12］在卵巢癌細(xì)胞株A2780和耐順鉑細(xì)胞株A2780/DDP中，轉(zhuǎn)染JNK-dn基因可抑制順鉑誘導(dǎo)的JNK的活性，阻斷順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；轉(zhuǎn)染JNK1-wt基因可使JNK持續(xù)活化，并使死亡配體FasL表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞凋亡率增加。提示野生型JNK1基因能逆轉(zhuǎn)A2780/DDP對(duì)順鉑的耐藥。Sanchez-Perez等［13］研究發(fā)現(xiàn) MAPK 磷酸酶CL100/MKP-1和Hvh-5的表達(dá)，可選擇性的抑制CDDP誘導(dǎo)的JNK的激活，進(jìn)而保護(hù)人類胚胎細(xì)胞（293T）免受CDDP誘導(dǎo)的凋亡。

由此可知，JNK信號(hào)通路在腫瘤耐藥中具有雙重作用，可能與細(xì)胞類型的不同、凋亡刺激物的特點(diǎn)、JNK活化持續(xù)時(shí)間以及其他信號(hào)通路的活化有關(guān)［5］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在肺腺癌A549細(xì)胞中，順鉑可激活JNK信號(hào)通路，同時(shí)上調(diào)肺耐藥蛋白LRP的表達(dá)，且具有濃度依賴性。用JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125抑制JNK的磷酸化后，LRP的表達(dá)明顯降低，抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，活化的JNK可經(jīng)核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核激活各自的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如 Elk-1、c-Jun、c-fos、ATP-2、p53、c-Myc以及非轉(zhuǎn)錄因子，如Bcl-2超家族（Bcl-2、Bcl-xl、Bim、BAD）［5］，通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié)，產(chǎn)生一系列廣泛而重要的生物學(xué)效應(yīng)，包括炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、細(xì)胞周期阻滯、凋亡等。Shimamoto等［14］發(fā)現(xiàn)在人結(jié)直腸癌SW-620細(xì)胞中順鉑可上調(diào)LRPmRNA及蛋白的表達(dá)，其機(jī)制可能與增強(qiáng)了LRP啟動(dòng)子的活性相關(guān)。Shinoda等［15］發(fā)現(xiàn)在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株GLC4和NCI-H82細(xì)胞株中，多柔比星可誘導(dǎo)MRP1和JNK的激活，用SP600125預(yù)處理或轉(zhuǎn)染JNK1/2反義寡核苷酸的細(xì)胞株，可見(jiàn)MRP1的表達(dá)明顯降低，與JNK信號(hào)通路的下游分子P-c-jun與MRP1的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)MRP1的表達(dá)有關(guān)。

LRP與MRP、P-gp同屬于MDR的經(jīng)典途徑，以及活化的JNK對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用，由此我們推論，活化的JNK信號(hào)通路上調(diào)LRP的表達(dá)，可能與激活的JNK信號(hào)通路相關(guān)分子與LRP啟動(dòng)子結(jié)合，增強(qiáng)其活性有關(guān)。

綜上所述，JNK信號(hào)通路參與了肺癌順鉑化療耐藥途徑，抑制JNK信號(hào)通路可通過(guò)下調(diào)LRP的表達(dá)增強(qiáng)其化療敏感性，故對(duì)JNK信號(hào)通路的深入研究有望為肺癌治療提供新的靶點(diǎn)。

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（2013-06-30收稿）

（2013-08-12修回）