劉 凱 趙光磊 何北海 陳禮輝 黃六蓮

(1.福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院，福建福州，350002;2.華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州，510640)

對(duì)于以木材為主要原料的制漿造紙廠，特別對(duì)我國南方以馬尾松為主要原料生產(chǎn)新聞紙的紙廠來說，樹脂障礙問題一直是生產(chǎn)中的一大難題。在制漿造紙過程中，樹脂以多種形式沉積在制漿造紙?jiān)O(shè)備表面，并產(chǎn)生一系列的樹脂障礙問題，樹脂障礙造成的危害主要有產(chǎn)品質(zhì)量下降及由紙機(jī)可操作性差而引起的產(chǎn)量降低。另外，隨著現(xiàn)代化紙廠用水封閉循環(huán)的日趨完善，造紙用材種類的擴(kuò)展以及堿性抄紙技術(shù)的應(yīng)用等因素的影響，樹脂障礙問題將日益突出［1-2］。

樹脂中的三油酸甘油酯(TG)是產(chǎn)生樹脂障礙的主要有害組分之一，三油酸甘油酯是非極性組分，在白水循環(huán)回用過程中很容易通過范德華力黏附在一些憎水性設(shè)備的表面上，從而形成大量的樹脂沉積物［3］。利用生物技術(shù)控制樹脂障礙問題是切實(shí)可行的方法，國內(nèi)外都已經(jīng)開展了這方面的研究。此方法主要是利用脂肪酶將樹脂中的酯類物質(zhì)水解成低黏性的脂肪酸和醇類，從而達(dá)到控制樹脂沉積的目的［4-5］。但在利用脂肪酶控制樹脂沉積物時(shí)，由于游離脂肪酶無法回收利用，不僅造成了脂肪酶的浪費(fèi)，還給工廠帶來了過高的處理成本。為了實(shí)現(xiàn)脂肪酶的回收利用，本實(shí)驗(yàn)采用先進(jìn)的生物酶固定化技術(shù)對(duì)脂肪酶進(jìn)行固定化處理，并考察固定化脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)，為利用固定化脂肪酶控制樹脂障礙提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 原料及藥品

堿性脂肪酶(A-2X)，諾維信生物科技有限公司;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，以下簡(jiǎn)稱 EDC)，純度 ＞98.5%，上海晶純?cè)噭┯邢薰?聚乙烯醇(PVA，AH-26)，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;橄欖油，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;三油酸甘油酯(TG)，化學(xué)純，上海晶純?cè)噭┯邢薰尽?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖微球的制備

稱取2 g殼聚糖粉末溶解在100 mL 5%的乙酸溶液中，緩慢加熱至50℃，攪拌使其完全溶解，然后吸入注射器中并慢慢滴入由NaOH(濃度2 mol/L)與無水乙醇(NaOH溶液與無水乙醇體積比4∶1)組成的凝結(jié)劑中，充分?jǐn)嚢枋蛊淠坛深w粒狀，浸泡3 h后，抽濾并用去離子水充分洗滌至pH值為中性。

1.2.2 單元固定化脂肪酶［6］

方法Ⅰ:稱取3 g殼聚糖微球加入10 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDC溶液，室溫下置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中活化反應(yīng)1 h后，用去離子水洗去殘余的EDC。然后加入5 mL稀釋至一定濃度的堿性脂肪酶，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩反應(yīng)3 h后，用去離子水洗去殘余酶液，并置于4℃的冰箱中冷藏備用。

方法Ⅱ:稱取3 g殼聚糖微球加入10 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液，室溫下置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中交聯(lián)反應(yīng)1 h后，用去離子水洗去殘余戊二醛。然后加入5 mL稀釋至一定濃度的堿性脂肪酶，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩反應(yīng)3 h后，用去離子水洗去殘余酶液，并置于4℃的冰箱中冷藏備用。

1.2.3 雙元固定化脂肪酶［7］

方法Ⅲ:稱取3 g殼聚糖微球加入10 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的EDC溶液，室溫下置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中活化反應(yīng)30 min后，用去離子水洗去殘余EDC。然后加入5 mL稀釋至一定濃度的堿性脂肪酶，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩反應(yīng)1 h后，傾倒出多余酶液，加入10 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中交聯(lián)反應(yīng)30 min。然后用去離子水洗去殘余戊二醛，加入5 mL稀釋至一定濃度的堿性脂肪酶，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩反應(yīng)3 h后，用去離子水洗去殘余酶液，并置于4℃的冰箱中冷藏備用。

方法Ⅳ:稱取3 g殼聚糖微球加入10 mL一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液，室溫下置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中交聯(lián)反應(yīng)30 min后，用去離子水洗去殘余戊二醛。然后加入5 mL稀釋至一定濃度的堿性脂肪酶，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩反應(yīng)1 h后，傾倒出多余酶液，加入10 mL一定濃度的EDC溶液，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中活化反應(yīng)30 min。然后用去離子水洗去殘余EDC，加入5 mL稀釋至一定濃度的堿性脂肪酶，置于轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中振蕩反應(yīng)3 h后，用去離子水洗去殘余酶液，并置于4℃的冰箱中冷藏備用。

1.2.4 脂肪酶酶活與蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用橄欖油乳化法［8］測(cè)定脂肪酶的酶活，在50℃、pH值7.5(對(duì)游離脂肪酶)或55℃、pH值8.5(對(duì)固定化脂肪酶)。每分鐘水解橄欖油釋放出1 μmol游離脂肪酸所需脂肪酶的量，定義酶活為1 U。

采用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.5 固定化脂肪酶的酶活回收率

1.2.6 pH值對(duì)固定化脂肪酶酶活與穩(wěn)定性的影響

(1)對(duì)酶活的影響

分別測(cè)定游離脂肪酶與固定化脂肪酶在不同pH值緩沖液中催化分解橄欖油的酶活。反應(yīng)體系:游離脂肪酶1 mL，溫度50℃;固定化脂肪酶1 g，溫度55℃。

(2)對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

分別將一定量的游離脂肪酶和固定化脂肪酶置于不同pH值的緩沖液中保溫1 h后，分別測(cè)定游離脂肪酶(在 pH值7.5、50℃)和固定化脂肪酶(在pH值8.5、55℃)的酶活。

1.2.7 溫度對(duì)固定化脂肪酶酶活與穩(wěn)定性的影響

(1)溫度對(duì)酶活的影響

分別測(cè)定游離脂肪酶與固定化脂肪酶在不同溫度下(35～65℃)催化分解橄欖油的酶活。反應(yīng)體系:游離脂肪酶1 mL，pH值7.5;固定化脂肪酶1 g，pH值8.5。

(2)溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響

分別將一定量的游離脂肪酶和固定化脂肪酶置于pH值8.0和8.5的磷酸緩沖液中，在不同的溫度下(20～60℃)保溫1 h后，分別測(cè)定游離脂肪酶在pH值7.5、50℃下和固定化脂肪酶在pH值8.5、55℃下的酶活。

1.2.8 固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性

在最優(yōu)固定化條件下制備固定化脂肪酶，以橄欖油乳液為底物，在pH值 8.5、55℃下反應(yīng)30 min，每次催化反應(yīng)后將固定化脂肪酶從反應(yīng)液中回收，用磷酸緩沖液清洗后重新加入到新的反應(yīng)液中，并檢測(cè)其酶活。通過考察固定化脂肪酶的相對(duì)酶活隨重復(fù)使用次數(shù)的變化，確定固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性。

1.2.9 固定化脂肪酶對(duì)TG的催化水解性能

量取25 mL TG乳液加入到25 mL pH值8.5的磷酸緩沖液中，混合均勻后再加入3.3 g固定化脂肪酶，置于55℃水浴中攪拌反應(yīng)，每隔5 min取一定量樣品測(cè)定TG濃度。TG濃度是利用0.05 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液在自動(dòng)電位滴定儀上滴定(至pH值10.3為終點(diǎn))并計(jì)算得出的。

2 結(jié)果與討論

2.1 EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

碳二亞胺類化合物對(duì)生物酶的毒性非常小，還可與殼聚糖的羥基直接交聯(lián)形成一種?；^渡態(tài)中間體，從而將生物酶分子固定化到殼聚糖上。因此，碳二亞胺類化合物是一種非常適合用來固定脂肪酶的活化劑［6］。在單元固定化脂肪酶過程中，首先考察了活化劑EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，隨著活化劑EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，固定化脂肪酶的相對(duì)酶活先提高后下降，當(dāng)EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，固定化脂肪酶相對(duì)酶活最大。可見，隨著EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，可起到加強(qiáng)固定化的作用，但濃度過高會(huì)導(dǎo)致脂肪酶失活。而根據(jù)Chiou等人［6］的研究可知，利用EDC活化殼聚糖微球固定化脂肪酶的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)控制在0.25%左右，這與本研究結(jié)果基本一致。

圖1 EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

2.2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

使用戊二醛交聯(lián)固定化生物酶是常用的固定化方法之一，但戊二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶的酶活影響很大［9-10］。實(shí)驗(yàn)考察了戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，固定化脂肪酶酶活逐漸降低。戊二醛是一種雙功能試劑，其雙醛基可以與殼聚糖分子和酶分子上的氨基發(fā)生希夫(Schiff)堿反應(yīng)，從而將生物酶分子固定在殼聚糖微球上，但過量的戊二醛會(huì)使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，導(dǎo)致酶活下降［11-12］。由于各種生物酶的結(jié)構(gòu)與活性都不相同，在固定化過程中受戊二醛的影響也有差異，但戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)就會(huì)使造紙用堿性脂肪酶迅速失活。Hung等人［7］的研究結(jié)果表明，戊二醛交聯(lián)固定化脂肪酶的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)保持在0.0025%左右。由圖2可知，戊二醛交聯(lián)固定化脂肪酶的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.0025%。

圖2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

2.3 固定化方法對(duì)固定化脂肪酶酶活的影響

為了獲得最高的固定化脂肪酶酶活，本實(shí)驗(yàn)采用4種方法對(duì)堿性脂肪酶進(jìn)行固定化處理，即分別為2種單元固定化和2種雙元固定化方法，得到的固定化脂肪酶酶活如表1所示。從表1可以看出，單獨(dú)使用戊二醛交聯(lián)載體后進(jìn)行脂肪酶的固定化，固定化脂肪酶酶活和蛋白質(zhì)含量均較低，只有15.6 U/g殼聚糖和117.3 μg/g殼聚糖。同樣，單獨(dú)使用EDC活化載體后進(jìn)行脂肪酶的固定化，固定化脂肪酶酶活和蛋白質(zhì)含量也較低，僅僅只有14.2 U/g殼聚糖和81.7 μg/g殼聚糖。但采用雙元固定化方法，即對(duì)載體既活化又交聯(lián)后，殼聚糖載體上的蛋白質(zhì)含量增加，固定化脂肪酶酶活也迅速提高。其中，使用方法Ⅲ固定化后，固定化脂肪酶酶活和蛋白質(zhì)含量分別達(dá)到64.6 U/g殼聚糖和 253.7 μg/g殼聚糖，且酶活回收率也達(dá)到最大值。而使用方法Ⅳ固定化后，固定化脂肪酶酶活和蛋白質(zhì)含量都比使用方法Ⅲ稍低。因此，可以確定采用方法Ⅲ進(jìn)行脂肪酶的固定化最優(yōu)。

表1 不同固定化方法下的固定化脂肪酶酶活

2.4 pH值對(duì)游離和固定化脂肪酶酶活的影響

在50和55℃的反應(yīng)體系中，游離和固定化脂肪酶在不同pH值緩沖液(pH值6.0～9.0)中的相對(duì)酶活如圖3所示。與游離脂肪酶相比，雙元固定化脂肪酶的最適pH值從7.5漂移到8.5。這主要是因?yàn)榻?jīng)過EDC的活化，使得帶正電荷的殼聚糖載體轉(zhuǎn)變成為帶負(fù)電荷的載體，因此，固定化脂肪酶的最適pH值向堿性范圍漂移。由于目前中堿性抄紙占主導(dǎo)地位，固定化脂肪酶非常適合用于處理中堿性造紙過程中形成的樹脂類沉積物。

圖3 pH值對(duì)游離和固定化脂肪酶酶活的影響

2.5 pH值對(duì)游離和固定化脂肪酶穩(wěn)定性的影響

為了研究游離和固定化脂肪酶的酸堿穩(wěn)定性，將固定化脂肪酶和游離脂肪酶在不同pH值緩沖液(pH值4.0～10.0)中保溫1 h后，測(cè)定其相對(duì)酶活并進(jìn)行比較，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，在pH值5.0時(shí)，固定化脂肪酶的相對(duì)酶活可保持85%左右，游離脂肪酶的相對(duì)酶活卻只能保持70%左右;而在pH值大于9.0的條件下，固定化脂肪酶的相對(duì)酶活可保持80%左右，游離脂肪酶的相對(duì)酶活卻只能保持約75%左右。這說明脂肪酶經(jīng)雙元固定化后pH值的穩(wěn)定性得到一定程度的提高，可滿足中堿性條件下控制樹脂沉積物的需要。

2.6 溫度對(duì)游離和固定化脂肪酶酶活的影響

溫度是影響生物酶活性的重要參數(shù)之一，在35～65℃的范圍內(nèi)分別研究了游離和固定化脂肪酶的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，經(jīng)過雙元固定化后，脂肪酶最適反應(yīng)溫度從50℃升至55℃。在最適反應(yīng)溫度之后，隨著溫度的升高固定化脂肪酶的相對(duì)酶活下降速度明顯小于游離脂肪酶。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到65℃時(shí)，游離脂肪酶的相對(duì)酶活下降到55%左右，而固定化脂肪酶的相對(duì)酶活仍能保持在65%左右，這表明脂肪酶經(jīng)過固定化后具有更廣的溫度使用范圍，能滿足處理較高溫度造紙白水的要求。造紙白水溫度一般在50～60℃之間，固定化脂肪酶在該溫度范圍內(nèi)可保持最高酶活，可發(fā)揮出較好的控制樹脂沉積物的效果。

2.7 溫度對(duì)游離和固定化脂肪酶穩(wěn)定性的影響

為了考察固定化脂肪酶和游離脂肪酶的熱穩(wěn)定性，將其分別置于不同溫度(20～60℃)的磷酸緩沖液中，保溫1 h后檢測(cè)其相對(duì)酶活(見圖6)。從圖6可以看出，在40℃保溫，固定化脂肪酶可保持約90%的相對(duì)酶活，而游離脂肪酶只能保持約80%的相對(duì)酶活;在60℃保溫，固定化脂肪酶還可保持約40%的相對(duì)酶活，而游離脂肪酶只能保持約20%的相對(duì)酶活，這表明經(jīng)過固定化后脂肪酶的熱穩(wěn)定性得到了一定程度的提高。因此，固定化脂肪酶更加適合用于較高溫度下造紙系統(tǒng)中樹脂沉積物的控制。

2.8 固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性

操作穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)固定化脂肪酶的主要指標(biāo)之一。為了考察固定化脂肪酶的重復(fù)使用性，對(duì)其進(jìn)行連續(xù)8次酶活測(cè)定操作，并計(jì)算每次使用后的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，固定化脂肪酶的相對(duì)酶活隨回用次數(shù)的增加而逐漸降低，但在連續(xù)使用5次后相對(duì)酶活仍保持在70%左右的較高的水平上;連續(xù)使用8次后，還能保持59%的相對(duì)酶活。在多次回用過程中，雖然會(huì)引起生物酶的部分失活，但該固定化脂肪酶所具有的優(yōu)良的操作穩(wěn)定性，為在實(shí)際生產(chǎn)過程中的重復(fù)利用提供了保障。

圖7 固定化脂肪酶的回用性能

2.9 固定化脂肪酶對(duì)TG的催化水解性能

為了考察固定化脂肪酶對(duì)樹脂膠黏物的控制效果，特別選擇TG為樹脂膠黏物的模型物。圖8是固定化脂肪酶對(duì)TG的催化水解性能。從圖8可以看出，在55℃反應(yīng)溫度下，隨著水解時(shí)間的延長，油酸濃度急劇增加。當(dāng)催化水解150 min時(shí)，經(jīng)固定化脂肪酶水解生成的油酸濃度達(dá)到154 mmol/L。這說明固定化脂肪酶在55℃反應(yīng)溫度下對(duì)TG具有強(qiáng)烈的催化水解性，非常適合用于白水中樹脂膠黏物的控制。

圖8 固定化脂肪酶對(duì)TG的催化水解性能

3 結(jié)論

采用生物酶固定化技術(shù)，通過4種方法對(duì)造紙用堿性脂肪酶進(jìn)行固定化處理，其中利用先進(jìn)行碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化然后進(jìn)行戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球的方法固定化脂肪酶，可使固定化脂肪酶酶活和蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高。脂肪酶經(jīng)過固定化后，最適溫度從50℃升高到55℃，最適 pH值從7.5上升到8.5，并且脂肪酶的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及操作穩(wěn)定性都得到明顯提高。這些結(jié)果表明，脂肪酶經(jīng)過固定化后不僅更加適合控制中堿性抄紙過程中形成的樹脂沉積物，還可實(shí)現(xiàn)脂肪酶的回收利用。

［1］陳建平，黃儒珠，陳 靜，等.用堿性脂肪酶消除磨木漿的樹脂障礙的探索［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，16(1):94.

［2］王 旭，詹懷宇.樹脂障礙生物控制技術(shù)進(jìn)展［J］.中國造紙，2001，20(6):58.

［3］李勝樹.生物酶樹脂控制的實(shí)踐［J］.中華紙業(yè)，2003，24(7):32.

［4］陳守勤，林一亭.用生物酶技術(shù)克服樹脂障礙［J］.國際造紙，2001，20(5):1.

［5］Rundlof M，Eriksson M，Stron H，et al.Effect of mannanase and lipase on the properties of colloidal wood extractives and their interaction with mechanical pulp fines［J］.Cellulose，2002，9:127.

［6］Chiou S H，Wu W T.Immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan with activation of the hydroxyl groups［J］.Biomaterials，2004，25:197.

［7］Hung T C，Giridhar R，Chiou S H，et al.Binary immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2003，26:69.

［8］Tang Z X，Qian J Q，Shi L E.Characterizations of immobilized neutral lipase on chitosan nano-particles［J］.Materials Letters，2007，61:37.

［9］許敬亮，袁振宏，張 宇，等.氨基功能載體固定化酶研究進(jìn)展［J］.化工進(jìn)展，2010，29(3):494.

［10］劉 穎，高 晗，范婷婷.殼聚糖-戊二醛交聯(lián)吸附法固定β-葡萄糖苷酶的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(5):315.

［11］Zhang Y D，Zhang Y，Jiang J J，et al.Surface derivatization with spacer molecules on glutaraldehyde-activated amino-microplates for covalent immobilization of beta-glucosidase［J］.Applied Surface Science，2011，257(7):2712.

［12］Yigitoglu M，Temocin Z.Immobilization of Candida rugosa lipase on glutaraldehyde-activated polyester fiber and its application for hydrolysis of some vegetable oils［J］.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2010，66(1/2):130.