蘭貴紅 ，洪 霞 ，葛婷婷 ，張衛(wèi)艷 ，安 陽 ，張 文

(1.西南石油大學(xué)，a.油氣藏地質(zhì)及開發(fā)工程國家重點實驗室；b.化學(xué)化工學(xué)院，四川 成都 610500；2.中原油田采油工程技術(shù)研究院，河南 濮陽 457000)

一株分離于植物根系油污土壤Bacillus spp.X-2菌的生理特征與修復(fù)活性分析

蘭貴紅1a，1b，洪 霞1b，葛婷婷1b，張衛(wèi)艷3，安 陽1b，張 文1b

(1.西南石油大學(xué)，a.油氣藏地質(zhì)及開發(fā)工程國家重點實驗室；b.化學(xué)化工學(xué)院，四川 成都 610500；2.中原油田采油工程技術(shù)研究院，河南 濮陽 457000)

從油污植物根系分離高效烴降解產(chǎn)表面活性劑菌株，并解析其主要的生理特征與原油的生物修復(fù)作用。從原油污染的植物根系土壤中分離、篩選出1株產(chǎn)表面活性劑高的菌株X-2，采用微生物生理分析其代謝特征，薄層層析、FTIR檢測生物表面活性劑性質(zhì)，烴代謝試驗與GC-MS解析其石油烴降解特征。結(jié)果表明：菌株X-2為桿狀，其16S rRNA與Bacillus cereus NC740相似性最高為99.7%，菌株能在15～45℃(最適溫度為32℃)，pH范圍為4.5～10.0(最適為7.0)，NaCl的耐受性為0～15 g/L，葡萄糖、氯化銨為菌株生長較適應(yīng)的碳源與氮源。薄層層析與傅立葉紅外分析表明菌株X-2產(chǎn)生的表面活性劑為甘油糖脂類物質(zhì)，烴降解實驗與GC-MS分析表明菌株X-2對石油烴有良好的降解能力，其主要降解分子量小于C23的直鏈烷烴，對甲苯與二甲苯等小分子的芳香烴也有一定的降解能力。

生物表面活性劑；原油生物降解；鑒定；生理特征

石油作為目前主要的能源之一，是一種復(fù)雜的多組分混合物，主要由烴類(烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴)，與非烴組分(如一些雜環(huán)烴的衍生物、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)等)[1]。石油污染進入環(huán)境會對水體、大氣與土壤造成嚴重的生態(tài)影響。就土壤而言，80%以上的落地原油被截留表層與淺層植物根系土壤[2]，不僅破壞影響土壤通透性，對農(nóng)作物的生長和發(fā)育造成巨大的負面影響[3]；同時會通過根系吸收殘留在植物體內(nèi)，通過食物鏈影響人畜健康[4]。20世紀80年代以來，土壤的石油烴類污染問題一直受世界各國普遍關(guān)注。產(chǎn)生物表面活性劑微生物是近幾年發(fā)展較快的一類具有較強石油污染生物修復(fù)功能的微生物，其主要的原因是生物表面活性劑具有石油污染乳化性強、對環(huán)境無毒害、生物易降解的優(yōu)點[5]。劉有勢[6]等利用生物表面活性劑鼠李糖脂洗脫多氯聯(lián)苯污染的土壤，去除90.1%的人工污染的多氯聯(lián)苯。Harvey與他的同事[7]將Pseudomonas aeruginosa 菌與其產(chǎn)生的海藻糖脂，加入阿拉斯加海灣Exxon Valdez號油輪號油輪泄漏所致的原油污染海水與沙灘，大大的提高了原油的生物修復(fù)效率，也是目前規(guī)模最大最成功的一次現(xiàn)場生物修復(fù)。本研究從石油污染的植物根系土壤中分離篩選出產(chǎn)生物表面活性劑的烴降解菌株，對其進行基本的生理特征、生物表面活性劑的分析，并能過GC-MS研究它對原油污染修復(fù)活性。

1 材料與方法

1.1 污染植物根系土樣

土樣采自四川南充煉油廠附近石油污染的去表層植物根系土壤。

1.2 培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基(g/L)：NaNO32.0 g, KH2PO41.0 g, K2HPO42.0 g, 尼克酸 0.01 g, MgSO4.7H2O 0.01 g,CaCl2.2H2O 0.1 g, FeSO4.7H2O 0.02 g 與 1 mL 微量元素 (pH 7.0)。微量元素的組成參照文獻[8]。

1.3 菌株富集與分離

取1 g污染土壤至100 mL含有0.2%原油的無機鹽培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶內(nèi)，37℃搖瓶培養(yǎng)2 d后，再連續(xù)轉(zhuǎn)富兩次，涂布培養(yǎng)待長出菌落后挑取不同形態(tài)和顏色的單菌落分別再劃線；菌株活性以排油圈[9-10]、乳化性能E24評價法進行測定[11]與接入5%菌株對50 mL的培養(yǎng)體系中5 g原油的乳化性能觀察。分離出一株產(chǎn)表面活性劑活性最強的菌株，命為X-2，于-20℃甘油管保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 菌株生理特征與16S rRNA 序列測定

顯微鏡觀察菌體形態(tài)，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》與常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[12]進行菌株的生理生化鑒定，細胞脂肪酸的組成測定參照文獻[13]。利用天根細菌基因組DNA試劑盒(北京天根生化科技)提取菌株X-2的DNA，利用引物27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')與1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行PCR擴增，擴增體系參照[14]，回收PCR產(chǎn)物，連接至載體PMD-19T后，轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中挑取陽性克隆送到上海英俊公司測序。測得的16S rRNA序列到NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，選取與之相似性最高的菌株16S rRNA序列，進行ClustalX 2.0比對，MEGA 4.1分析，利用Neighbor-Joining法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，Bootstrap 1000次進行穩(wěn)定性的驗證。

1.5 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在無機鹽培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、液體石蠟、植物油與甘油代謝原油作為碳源(0.5%)，氯化銨、蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、硝酸鈉、硫酸銨、牛肉膏為氮源(0.2%)，進行菌株X-2的碳源與氮源培養(yǎng)優(yōu)化試驗；以不同的溫度梯度 (15、20、25、28、30、32、35、37、42、45、50 ℃ )，pH 值 (4.0、4.5，5.5，6.0、6.5、6.8、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5)及 NaCl濃度 (0、2、5、10、15、20、25、30、35、40 g/L)下培養(yǎng)3d 后用752分光光度儀測定其560 nm處的OD值，確定菌株的最適生長條件。

1.6 表面活性劑提取及定性分析

參照文獻[15]萃取、濃縮并干燥表面活性劑粗產(chǎn)物，進行薄層層析[16]與傅立葉紅外光譜分析[17]。

1.7 菌株對不烴組分生長及原油的降低解測試

以原油、煤油、柴油、正已烷，正十六烷、正庚烷、異辛烷、苯、甲苯作為唯一碳源進行菌株對烴類物質(zhì)的降解作用分析。碳源濃度為0.5% (v/v)，將5 mL種子加入到含各種烴的無機鹽培養(yǎng)液中200 r/min，37℃ 培養(yǎng)7 d。比較菌株對不同烴類物質(zhì)的降解作用。以各種不含菌的培養(yǎng)基空白對照，比較培養(yǎng)物的濁度，觀察菌的生長情況，同時參照文獻[18-19]將原油從培養(yǎng)液中萃取出來并進行GC-MS檢測原油的降解情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

經(jīng)過富集培養(yǎng)、平板初篩，從石油污染的土壤中分離到3株產(chǎn)表面活性劑的烴降解微生物，其X-1，X-2與X-3。其中X-2的排油圈直徑與E24最大，其排油圈直徑約為4 cm，E24為78%（見圖1），菌株與原油培養(yǎng)1周后原油與培養(yǎng)液形成了一個較均勻的濁液(見圖2)，于是本研究以X-2進行進一步的研究分析。

圖1 菌株X-2產(chǎn)表面活性劑的排油圈與E24(a:排油圈；b:乳化初始；c:乳化24h后)Fig. 1 Diameter of oil spreading and Emulsification activity (E24) of the crude biosurfactant produced by X-2 (a∶ Diameter of oil spreading; b∶ Emulsion to the initial; c∶ Emulsion after 24 h)

圖2 菌株X-2原油乳化培養(yǎng)圖(a:空白對對照,b:接入菌株后培養(yǎng)1周)Fig.2 Appearance of inoculated (each left sub-figure) and control (right) shaking flasks incubated with crude oil at 37℃ for 7 d

2.2 菌株生理特征與16S rRNA 序列測定

菌株X-2為桿狀細菌，其生理特征鑒定如下：菌落光滑、圓形、隆起，菌體桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色、硫化氫試驗、甲基紅試驗、葡萄糖發(fā)酵與油脂水解試驗陽性，檬酸鹽利用試驗、V.P試驗、脂酶試驗與明膠液化試驗陰性。菌株細胞脂肪酸主要組成為：14∶0，16∶1ω7，16∶0，18∶0，18∶1ω9。提交菌株X-2的16S rRNA 序列，GenBank中BLAST比對結(jié)果顯示同源性在99%以上的菌絕大多數(shù)是芽胞桿菌。如圖3所示，X-2與最近緣的菌株是Bacillus cereus NC7401 核苷酸序列同源性為99.7%。菌株X-2的16S rRNA序列登錄號為 KC147694。

2.3 菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

通過培養(yǎng)優(yōu)化試驗菌株X-2以葡萄糖與氯化銨為最適生長碳源和氮源，其溫度生長范圍為15～45℃(最適溫度為32℃)，pH范圍為4.5～10.0 (最適pH為7.0)，NaCl的耐受性為0～15 g/L。

圖3 菌株X-2 16S rRNA的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of X-2 and its related bacteria constructed using 16S rRNA sequences

2.4 表面活性劑的定性分析

微生物產(chǎn)表面活性劑主要有糖脂、脂肽、磷脂、脂肪酸中性脂和結(jié)合多糖、蛋白質(zhì)的高分子、復(fù)合物等[8]，通過薄層層析分析發(fā)現(xiàn)菌株所產(chǎn)生的表面活性劑為糖脂類；FTIR圖譜(如圖4)分析顯示3 442 cm-1處的寬吸收峰為糖的-OH伸縮振動所致；2 925 cm-1、2 856 cm-1是親油的碳氫鏈中C-H伸縮振動所致，表明分子中存在-CH2-；1 720 cm-1是典型的與飽和脂肪鏈相連接的C=O伸縮振動峰；1 459 cm-1是由C-H或O-H變形振動引起，1 166 cm-1典型的酯吸收峰，參照文獻[20]進一步證實道菌株X-2產(chǎn)生的表面活性劑為糖脂類。

圖4 菌株X-2產(chǎn)生的表面活性劑的傅立葉紅外圖Fig.4 Fourier transform Infrared spectrum of biosurfactant produced by X-2

2.4 不同烴組分對菌株生長的影響

近年來人們越來越重視生物表面活性劑用于烴類污染土壤與水體的治理[21-22]，通常產(chǎn)表面活性劑微生物都有一定的石油烴降解能力，由于不同菌株有著不同的烴降解特征，分析菌株的烴代謝活性，有助于了解菌株的生物修復(fù)活性，及微生物復(fù)合配方的研究。如產(chǎn)表面活性劑菌株Bacillus cereus 28BN 主要代謝多環(huán)芳香烴[23]，而菌株P(guān)seudomonas aeruginosa DQ8則能降解直鏈烷烴與部分多環(huán)芳香烴[5]。

烴組分對菌株生長影響測試結(jié)果如表1，菌株能在原油、煤油與柴油中生長良好；菌株在純直鏈脂肪烴中的生長較芳香烴好，菌株在n-C12、n-C16中生長最好，在n-C6、n-C7、甲苯，二甲苯中生長次之，在苯、萘、蒽中無生長。結(jié)果表明菌株主要代謝直鏈烷烴與低分子量的芳香烴。

表1 菌株X-2對烴類底物的利用情況?Table 1 Hydrocarbon substrates specificity of the X-2

2.5 菌株對原油的降解作用

GC-MS可以快速評價原油污染組份改變，解析產(chǎn)表面活性劑菌株潛在烴降解活性，通過菌株培養(yǎng)前后原油組分GC-MS分析(見圖5)，結(jié)果表明原油降解后芳香烴組分含量均有增加，苯類物質(zhì)含量從原來的2.5077%增加至4.82%，萘類及其衍生物從17.49%增加至30.27%(見圖6)，分析其原因可能是烷烴組分降解速率較芳烴快從而導(dǎo)致芳香烴富集，這與純烴類物質(zhì)代謝分析結(jié)果類似。

圖5 菌株X-2對石油烴降解GC-MS分析圖(a.降解前原油,b.降解后原油)Fig.5 GC-MS analysis of crude oil degradation by strain X-2 (a. before degradation of crude oil, b. after degradation of crude oil)

圖6 菌株X-2原油降解前后烷烴與芳香烴組分變化圖Fig.6 The change of alkanes and aromatic hydrocarbons components before and after degradation of crude oil

解析降解前后烷烴組成的變化(見圖7)，發(fā)現(xiàn)原油的烴組分的變化由原來的77.95%降低至61.61%，其小分子量的烷烴組分變化特點大，其中C12～C16均在降解后原油中無檢測，而C17，C18也有明顯的降低從原來的3.0%與2.67%降低至1.5%左右，而C19～C21也沒有檢測到，C22從原來的3.1%降至0.9%，C23基本沒有變化，而C24～C32降解后均明顯含量增加，這表明菌株主要以C22及以下分子量的烴作為碳源進行代謝，從而導(dǎo)致重質(zhì)烴組分相對富集。

圖7 菌株X-2原油降解前后烷烴組成比較變化圖Fig.7 The change of alkanes components before and after degradation of crude oil

3 結(jié) 論

通過菌株的生理特征、代謝活性、表面活性劑及烴降解性能分析，其結(jié)論如下：

(1)菌株X-2為桿菌，16S rRNA與Bacillus cereus NC740相似性最高為99.7%，菌株生長溫度范圍為15～45℃(最適溫度為32℃)，pH范圍為4.5～10.0(最適為7.0)，NaCl耐受性為0～15 g/L，葡萄糖與氯化銨為菌株生長較適應(yīng)的碳源和氮源。

(2)菌株X-2產(chǎn)生物表面活性劑的薄層層析與FTIR分析，表明菌株X-2產(chǎn)生的表面活性劑為糖脂類物質(zhì)。

(3)烴降解實驗與GC-MS分析，表明菌株X-2主要降解分子量小于C23的直鏈烷烴，對甲苯與二甲苯等小分子的芳香烴也有一定的降解能力。

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Isolation, identification and characteristics of hydrocarbon-degrading and bio-surfactant-producing Bacillus spp. X-2

LAN Gui-hong1a,1b, HONG Xia1b, GE Ting-ting1b, ZHANG Wei-yan2, AN Yang1b, ZHANG Wen1b
(1a. State Key Lab. of Oil and Gas Reservoir Geology and Exploitation; 1b. College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest Petroleum University, Chengdu 610500, Sichuan, China; 2.Petroleum Engineering Technology Research Institute, Sinopec Zhongyuan Oilfield, Puyang, 457000, Henan, China)

∶ Three petroleum-degrading and bio-surfactant-producing bacteria were isolated from crude oil-contaminated soil in Dagang oil field in China, one of them was chosen and its main metabolic characterization and crude oil degrading properties were analyzed,which had characteristics of highest surfactant. The taxonomic status was determined by morphological, physiological, biochemical and 16S rRNA gene sequence analysis. The bio-surfactant was detected by thin layer chromatography and Fourier transform infrared spectroscopy. The effect of petroleum degradation was measured by GC-MS analysis. The results show that the strain was identified as Bacillus spp. X-2, the temperature range for growth of the bacteria was 15～45℃ , the optimum was 32℃ ; The pH range for growth was 4.5～10.0, the optimum was about 7.0; Glucose and NH4Cl were the optimum carbon sources and nitrogen sources for bacteria growth, respectively; 16S rRNA gene sequence analysis indicated that the strain BF1 was similarity to Bacillus cereus NC740 (99.7%);Thin layer chromatography and Fourier transform infrared chromatography analysis showed that the bio-surfactant of strain X-2 was glycolipid. The exploration of the hydrocarbon degradation and GC-MS analysis of residual oil showed that the straight chain alkanes with chain length less than C23 were easily degraded by the strain, at the same time it also degraded some small molecules aromatic hydrocarbons such as toluene and xylene.

∶ bio-surfactant; petroleum biodegradation; identification; physiological characteristic

S714.3；S718.83

A

1673-923X(2013)11-0139-06

2013-08-16

西南石油大學(xué)油氣藏地質(zhì)及開發(fā)工程國家重點實驗室開放基金（PLN1134）；四川省科技廳科技成果轉(zhuǎn)化項目（11010124）

蘭貴紅（1976-），男，四川成都人，博士，主要從事環(huán)境生物技術(shù)的研究；E-mail：languihong@yahoo.com

張 文（1964-），男，四川成都人，高級實驗師，碩士，主要從事環(huán)境生物技術(shù)的研究；E-mail：zw0343@sina.com

[本文編校：吳 毅]