王云彪，李潤(rùn)琴，鄧茗芩，李鑄衡，徐鏡波

1.中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 濕地生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130102

2.吉林省電力科學(xué)研究院有限公司，長(zhǎng)春130021

3.東北師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系，長(zhǎng)春130024

砷(As)是常見(jiàn)的致癌污染物之一，砷的毒理作用會(huì)隨環(huán)境介質(zhì)改變而發(fā)生變化[1]。環(huán)境中污染物的種類和數(shù)量不斷增加，使得在許多類型的生態(tài)系統(tǒng)中以更大概率存在著一種以上的污染物[2]。隨著農(nóng)用化學(xué)品的大量使用，自然生態(tài)系統(tǒng)中存在無(wú)機(jī)污染物和農(nóng)藥復(fù)合污染的風(fēng)險(xiǎn)[3]，土壤及地下水中由砷污染引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注，而在農(nóng)田土壤和受面源污染的水體中，砷污染并非獨(dú)立存在，常常伴隨著砷與典型農(nóng)藥的復(fù)合污染[4]。農(nóng)藥與無(wú)機(jī)污染物的復(fù)合污染效應(yīng)包括農(nóng)藥與無(wú)機(jī)物之間復(fù)雜的交互作用和聯(lián)合毒性[5-6]，其生物學(xué)響應(yīng)是一個(gè)矢量[7]，復(fù)合污染研究是當(dāng)下環(huán)境毒理學(xué)和污染生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphate，簡(jiǎn)稱Ops)是當(dāng)今農(nóng)藥中的主要類別[8]。草甘膦(GPS)為廣譜性有機(jī)磷除草劑，是世界上應(yīng)用最廣，產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種[9－10]。敵敵畏(DDVP)是一種應(yīng)用最為廣泛的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑，已被確認(rèn)為外源性擾亂內(nèi)分泌化學(xué)物質(zhì)[11-12]。目前研究較多的是砷與敵敵畏的環(huán)境化學(xué)行為和單一污染毒性，已在基因和蛋白水平進(jìn)行了生物標(biāo)志物篩選;而草甘膦的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)尚待揭示[4,13]。污染物的聯(lián)合暴露毒性研究從無(wú)機(jī)物之間、有機(jī)物之間的研究，擴(kuò)展到現(xiàn)實(shí)環(huán)境中有機(jī)－無(wú)機(jī)物聯(lián)合暴露毒性評(píng)價(jià)，而秀麗隱桿線蟲(chóng)因其遺傳背景、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路清楚，行為和分子指標(biāo)豐富，以及具有實(shí)踐前景等優(yōu)勢(shì)，被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用到污染物的聯(lián)合暴露毒性評(píng)價(jià)研究中[14]。線蟲(chóng)被廣泛用作環(huán)境污染的指示生物[8,15]。而秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)已被廣泛用作模式生物進(jìn)行毒理學(xué)研究[16－17]。

本研究利用模式生物秀麗隱桿線蟲(chóng)探討砷與典型農(nóng)藥復(fù)合污染的毒理作用模式，為深入和細(xì)致探討典型無(wú)機(jī)－有機(jī)復(fù)合脅迫的毒理效應(yīng)和相互作用模式，提供了模式材料和判定方法參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)N2 株由美國(guó)線蟲(chóng)種質(zhì)中心提供，使用涂有大腸桿菌(Escherichia coli OP50)的NGM 培養(yǎng)基，在20℃下的生化培養(yǎng)箱中同步化培養(yǎng)。用KCl 和0.051 mol·L－1NaCl)作為母液配制合理濃度的亞砷酸鈉(NaAsO2，分析純，Sigma 生產(chǎn))、草甘膦(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41%的草甘膦異丙胺鹽水劑，安徽豐樂(lè)農(nóng)化有限責(zé)任公司生產(chǎn))和敵敵畏(體積分?jǐn)?shù)為77.5%的敵敵畏乳油溶液)，湖南南天實(shí)業(yè)股份有限公司生產(chǎn))染毒液，加于24 孔板中待用，每孔0.5 mL，每組3個(gè)平行。

1.2 LC50的計(jì)算

將秀麗隱桿線蟲(chóng)年輕成蟲(chóng)在不同濃度的染毒液中培養(yǎng)24 h 后計(jì)算死亡數(shù)，根據(jù)各個(gè)濃度的存活率，以直線內(nèi)插法推導(dǎo)做出回歸曲線，并計(jì)算出該毒物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的24 h 半數(shù)致死濃度LC50。再按經(jīng)驗(yàn)公式求出安全濃度:農(nóng)藥安全濃度=24 h－LC50×0.1。敵敵畏密度為1.415 g·L－1(25℃)。

1.3 復(fù)合脅迫方式判定

根據(jù)獲得的每種毒物24 h－LC50值，將亞砷酸鈉、草甘膦和敵敵畏脅迫強(qiáng)度分別設(shè)置為L(zhǎng)C50值的1/5(1/5 LC50)，LC50值的1/2(1/2 LC50)，LC50值，作為各種毒物的濃度，計(jì)算2 種物質(zhì)所需的濃度和體積配成等毒性溶液，進(jìn)行亞砷酸鈉與草甘膦，亞砷酸鈉與敵敵畏的聯(lián)合毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn);同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)脅迫強(qiáng)度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，每一脅迫強(qiáng)度下放置10 條處于壯年(young adult)階段線蟲(chóng)，染毒24 h 后在顯微鏡下觀察每組線蟲(chóng)死亡數(shù)。綜合等效應(yīng)線圖法、相加指數(shù)法和Finney 法[18－19]，若2 種毒物單一脅迫下秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率之和大于聯(lián)合毒性，即為拮抗效應(yīng);若2 種毒物單一毒性之和小于聯(lián)合毒性，即為協(xié)同效應(yīng);若2 種毒物單一毒性之和等于聯(lián)合毒性，則為相加作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 12 軟件分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。LC50計(jì)算中，先將脅迫濃度轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值進(jìn)行毒力回歸分析，并統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 3 種污染物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)單一毒性

單一脅迫下，砷、草甘膦及敵敵畏對(duì)野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)N2 株的24 h 毒性分析如表1 所示。研究結(jié)果表明，這3 種毒物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)都表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性。As 表現(xiàn)出重金屬的毒性特征，其對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)24 h－LC50值與Pb、Cr 相近[15]。敵敵畏作為典型殺蟲(chóng)劑，對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)表現(xiàn)出極強(qiáng)的毒性作用，其安全 濃度為0.47 μg·L－1，而中國(guó)(GHZB1—1999)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(I、II、III 類水域)規(guī)定敵敵畏濃度上限為0.1 μg·L－1。特別指出的是，草甘膦作為一種有機(jī)磷除草劑，對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的24 h－LC50為18.5 mg·L－1，表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性作用。在較低濃度(1.85 mg·L－1)的草甘膦脅迫下，秀麗隱桿線蟲(chóng)即表現(xiàn)出異常的行為反應(yīng)。

2.2 砷與草甘膦對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性

根據(jù)等毒性效應(yīng)，砷與草甘膦濃度設(shè)置為1/5 LC50、1/2 LC50和LC50，觀測(cè)砷與草甘膦復(fù)合脅迫對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性效應(yīng)。如果秀麗隱桿線蟲(chóng)實(shí)測(cè)死亡率高于理論死亡率，則表明脅迫因子的復(fù)合作用為協(xié)同效應(yīng)。如圖1 所示，不同濃度的砷與濃度為1/5 LC50的草甘膦聯(lián)合作用下，實(shí)測(cè)秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率高于理論值，表明砷與低濃度草甘膦的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用，濃度為1/2 LC50和LC50的砷與1/5 LC50草甘膦的協(xié)同效應(yīng)顯著高于1/5 LC50砷與1/5 LC50草甘膦的協(xié)同效應(yīng)，表明低劑量的草甘膦即可顯著增強(qiáng)較高含量砷的毒性。中等脅迫強(qiáng)度的1/2 LC50草甘膦與砷的聯(lián)合毒性表現(xiàn)出相似的規(guī)律(圖2)，即草甘膦與高濃度砷的協(xié)同作用大于與低濃度砷的協(xié)同作用。而在濃度為L(zhǎng)C50的高強(qiáng)度草甘膦協(xié)同作用下，秀麗隱桿線蟲(chóng)在濃度為1/5 LC50的低強(qiáng)度砷染毒液中，24 h 時(shí)全部死亡(圖3)。結(jié)果表明，低濃度的砷與低濃度的草甘膦協(xié)同作用不顯著，低濃度的砷與高濃度的草甘膦表現(xiàn)出極強(qiáng)的協(xié)同作用，草甘膦對(duì)較高濃度的砷毒性協(xié)同作用明顯。

表1 砷、草甘膦及敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)24 h-LC50值及其回歸方程Table 1 Regression equations and 24 h-LC50 values of arsenic,glyphosate and dichlorvos to C.elegans

圖1 砷與濃度為1/5 LC50的草甘膦對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性Fig.1 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and glyphosate at concentration of 1/5 LC50 to C.elegans

圖2 砷與濃度為1/2 LC50的草甘膦對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性Fig.2 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and glyphosate at concentration of 1/2 LC50 to C.elegans

圖3 砷與濃度為L(zhǎng)C50的草甘膦對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性Fig.3 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and glyphosate at concentration of LC50 to C.elegans

2.3 砷與敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性

圖4 砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性Fig.4 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and dichlorvos at concentration of 1/5 LC50 to C.elegans

如圖4 所示，不同濃度的砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏24 h 聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)中，秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率明顯低于理論值，濃度為1/5 LC50的砷與1/5 LC50的復(fù)合脅迫下秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率，與濃度為1/5 LC50的敵敵畏單一脅迫下秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率相同;濃度為1/2 LC50的砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏聯(lián)合作用下，秀麗隱桿線蟲(chóng)死亡率接近為零，即濃度為1/5 LC50的敵敵畏可抵消濃度為1/2 LC50的砷對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性作用;而濃度為1/5 LC50的敵敵畏，可使?jié)舛葹長(zhǎng)C50的砷對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的單一致死率由50%降低至20%。濃度為1/2 LC50的敵敵畏與砷聯(lián)合作用下，對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的24 h 致死率維持在約20%的水平(圖5)，表明砷對(duì)濃度為1/2 LC50的敵敵畏的聯(lián)合毒性作用接近為零;需要指出的是，濃度為1/2 LC50的砷與敵敵畏的聯(lián)合作用效應(yīng)略低于濃度為1/5 LC50的砷聯(lián)合作用效應(yīng)。如圖6 所示，1/5 LC50的砷與濃度為L(zhǎng)C50的敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合致死率為28%，濃度為1/2 LC50的砷與濃度為L(zhǎng)C50的敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合致死率為20%，濃度為L(zhǎng)C50的砷與濃度為L(zhǎng)C50的敵敵畏聯(lián)合作用下，對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的24 h 致死率約為50%，等效于敵敵畏或砷的單一毒性。

綜上，砷與敵敵畏的聯(lián)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗作用，相同砷濃度下，這種拮抗效應(yīng)隨敵敵畏濃度增加而減弱;濃度為1/2 LC50的砷對(duì)敵敵畏的拮抗作用尤為顯著。濃度為1/5 LC50的砷與濃度為1/2 LC50敵敵畏，濃度為1/5 LC50的砷與濃度為L(zhǎng)C50敵敵畏，濃度為L(zhǎng)C50的砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏，濃度為L(zhǎng)C50的砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏，這4 個(gè)復(fù)合脅迫強(qiáng)度對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的致死率極為接近。

圖5 砷與濃度為1/2 LC50的敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性Fig.5 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and dichlorvos at concentrations of 1/2 LC50 to C.elegans

圖6 砷與濃度為L(zhǎng)C50的敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性Fig.6 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and dichlorvos at concentration of LC50 to C.elegans

3 討論(Discussion)

24 h 單一毒性是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 種毒物對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的急性毒性大小排序?yàn)?，砷＜草甘膦＜敵敵畏。尚沒(méi)有證據(jù)證明砷是生命必需元素，有研究發(fā)現(xiàn)低劑量下砷具有興奮作用，如砒霜作為中藥的療效作用，而在細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了As 可具有替代必須元素(P)的生物學(xué)作用[20]。砷對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)半數(shù)致死濃度與鉛、鉻相近，敵敵畏對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性與其他生物的脅迫響應(yīng)相近，表現(xiàn)為劇毒;而本研究結(jié)果表明，草甘膦對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的急性毒性大于砷，這說(shuō)明草甘膦對(duì)土壤中的非靶動(dòng)物存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[10]。

污染物的復(fù)合作用方式和途徑多種多樣，包括在機(jī)體外的化學(xué)反應(yīng)，在生命體內(nèi)的綜合作用等[6]。聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，砷與不同有機(jī)磷農(nóng)藥的復(fù)合作用模式都不同，不同濃度組合的聯(lián)合毒性效應(yīng)和作用程度都有所差異[21]。砷與草甘膦對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，草甘膦與砷并不發(fā)生直接的化學(xué)作用，但在生物體內(nèi)，草甘膦對(duì)機(jī)體的脅迫壓力可能會(huì)使生命體對(duì)砷的耐受性減弱，從而表現(xiàn)出砷的毒性作用增強(qiáng)。作為2 種典型有機(jī)磷農(nóng)藥的草甘膦和敵敵畏的生物毒理作用機(jī)制各不相同[22－23]，如草甘膦可能是通過(guò)生殖相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而敵敵畏具有神經(jīng)毒性。砷與敵敵畏可能發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)作用，包括絡(luò)合作用、氧化還原等[11]。梁繼東和周啟星[7]發(fā)現(xiàn)有機(jī)農(nóng)藥對(duì)重金屬有腐蝕作用，而銅可與甲胺磷的部分功能團(tuán)發(fā)生絡(luò)合，其復(fù)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用。三價(jià)砷被氧化或還原后毒性作用會(huì)降低，同時(shí)由于二甲基磷酸酯官能團(tuán)被破壞，也使得其毒性大為減弱。敵敵畏濃度為1/2 LC50和LC50時(shí)，分別與濃度為1/5 LC50的砷的聯(lián)合毒性相近，表明敵敵畏濃度變化，并不影響與砷的拮抗作用;砷濃度為L(zhǎng)C50時(shí)，分別與濃度為1/5 LC50和1/2 LC50的敵敵畏的聯(lián)合毒性作用相近，表明較低濃度的敵敵畏可顯著減低較高濃度砷對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的毒性作用。

自然環(huán)境中往往多種毒物并存，不同污染物間的聯(lián)合作用，如重金屬易與有機(jī)物形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，以及相同種類污染物的不同濃度組合，都會(huì)使污染物毒性較其單一毒性發(fā)生很大變化。這種聯(lián)合毒性效應(yīng)的判定方法有多種，本文所用的等效毒性相加法，不需復(fù)雜公式的計(jì)算，可直觀有效地判定2 種毒物的復(fù)合作用模式，并且通過(guò)理論與實(shí)測(cè)曲線對(duì)比圖，可大體判定2 種毒物的復(fù)合脅迫作用程度。秀麗隱桿線蟲(chóng)作為生命科學(xué)領(lǐng)域的典型模式生物，用其作為毒物聯(lián)合毒性模式判定的實(shí)驗(yàn)材料，具有操作簡(jiǎn)易、結(jié)論精確和端點(diǎn)豐富的優(yōu)勢(shì)[7－8]。應(yīng)用秀麗隱桿線蟲(chóng)進(jìn)行復(fù)合污染模式判斷，操作簡(jiǎn)單，易于觀測(cè)，結(jié)果清晰可信。而線蟲(chóng)類群是自然界數(shù)量最豐富、分布最廣的生物，已被廣泛用作污染生態(tài)學(xué)領(lǐng)域研究的指示生物，這使得利用秀麗隱桿線蟲(chóng)作為環(huán)境毒理學(xué)材料，更加具有實(shí)踐意義[24]。室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)和野外定位觀測(cè)相結(jié)合，將是應(yīng)用線蟲(chóng)這一自然界數(shù)量最豐富的類群進(jìn)行污染物的生物監(jiān)測(cè)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的必經(jīng)途徑。

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