薛美昭，儀慧蘭

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006

自然狀態(tài)下，砷以較低濃度廣泛存在于大氣、水和土壤中。近年來砷化合物在工、農(nóng)、醫(yī)藥業(yè)中的大量使用導(dǎo)致了環(huán)境的砷污染，部分地區(qū)土壤和水域環(huán)境中砷含量偏高，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康構(gòu)成威脅[1]。氧化損傷是目前公認(rèn)的砷毒性作用機(jī)制:無機(jī)砷可誘發(fā)生物機(jī)體內(nèi)超氧陰離子(O2·-)，羥基自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)的生成，這些活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)能破壞細(xì)胞膜及胞內(nèi)生物大分子如膜脂、蛋白和核苷酸[2]，進(jìn)而影響細(xì)胞和分子的結(jié)構(gòu)與功能，使細(xì)胞生理功能紊亂，導(dǎo)致疾病發(fā)生甚至死亡。近期研究證實(shí)，胞內(nèi)一定水平的ROS 分子具有信號(hào)分子的功能，參與介導(dǎo)多種生物學(xué)過程，但是ROS 在砷毒性作用過程中的信號(hào)作用機(jī)制還不清楚。

植物葉表面的氣孔保衛(wèi)細(xì)胞能夠?qū)Χ喾N內(nèi)外刺激如光、濕度、CO2和激素等做出反應(yīng)，是研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的模式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)[3-4]，對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)靈敏而準(zhǔn)確。近期，不少學(xué)者采用植物葉面保衛(wèi)細(xì)胞研究環(huán)境污染物氰化物、二氧化硫和鋁等的細(xì)胞毒性，揭示了環(huán)境化學(xué)物的毒性效應(yīng)及其作用途徑[5-7]，發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性ROS 在細(xì)胞死亡中的作用。因此，本研究以蠶豆氣孔保衛(wèi)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究NaAsO2對(duì)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的毒性效應(yīng)，為揭示砷毒性作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蠶豆(Vicia faba L.)種子清洗后用自來水浸泡48 h，25℃濕紗布包裹催芽2 ～3 d，然后播種于較肥沃的營養(yǎng)土中。培養(yǎng)條件:光暗周期為14 h/10 h，溫度18 ～25℃，光照強(qiáng)度240 μmol·m-2·s-1。幼苗長至4 周時(shí)取頂端第2 節(jié)完全展開的葉片，選非葉脈部位用鑷子撕取其下表皮，切成長約1 cm、寬約0.5 cm 的表皮條，置于含2-(N-morpholino)ethanesulfonic(MES)的表皮條緩沖液中。MES 緩沖液含MES，用三羥甲基氨基甲烷調(diào)節(jié)pH 至7.0。

1.2 藥物處理

用MES 緩沖液配制含NaAsO2濃度為0.1、0.3、1、3 和10 mg·L-1的溶液作為砷處理液。緩解組采用一定濃度拮抗劑分別與NaAsO2同時(shí)作用。MES 緩沖液作對(duì)照。每個(gè)處理用3 個(gè)不同蠶豆植株上的葉片，將表皮條置于含有不同藥物的處理液中，于23℃光照3 h 后檢測細(xì)胞活性和胞內(nèi)ROS 水平。

依據(jù)文獻(xiàn)資料，在砷處理液中加入外源抗壞血酸(AsA，1 mmol·L-1)和過氧化氫酶(CAT，1 000 U·mL-1)來降低砷脅迫引發(fā)的胞內(nèi)ROS 升高[8]，選用Ca2+特異性螯合劑乙二醇雙四乙酸(EGTA，1 mmol·L-1)和質(zhì)膜Ca2+通道抑制劑降低胞內(nèi)Ca2+水平[7]，用0.1 mmol·L-1的2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(PD98059)抑制促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activate protein kinase,MAPK)活性[9]。

1.3 細(xì)胞活性檢測

參照Yi 等實(shí)驗(yàn)方法[7]，藥物處理結(jié)束后，表皮條用0.1 mg·L-1的二乙酸熒光素(fluorescein diacetate,FDA)暗染10 min，熒光顯微鏡下觀察、拍照。統(tǒng)計(jì)無綠色熒光的保衛(wèi)細(xì)胞(死細(xì)胞)數(shù)與觀察的保衛(wèi)細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算保衛(wèi)細(xì)胞死亡率。每個(gè)處理至少選用3 個(gè)植株的不同葉片，每次至少觀察2 000 個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞。保衛(wèi)細(xì)胞死亡率(%)=死亡保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)/觀察保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 胞內(nèi)ROS 水平檢測

參照González 等的實(shí)驗(yàn)方法[10]，藥物處理結(jié)束后表皮條于10 μmol·L-1的活性氧熒光指示劑2',7'-二氯熒光黃雙乙酸酯(2',7'-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)中暗孵育30 min 后，熒光顯微鏡(激發(fā)波長488 nm)下觀察并拍照。使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0 測量每組3 個(gè)表皮條中約300 個(gè)細(xì)胞的熒光值，計(jì)算其平均值。將對(duì)照組熒光值計(jì)為1，各處理組的相對(duì)熒光值為處理組熒光值與對(duì)照組的比值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算每組3 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，采用SPSS17.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行F 檢驗(yàn)后，采用Duncan 方法進(jìn)行多重比較，分析不同處理組和對(duì)照組之間的差異顯著性。

2 結(jié)果(Results)

2.1 砷處理對(duì)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞活性的影響

根據(jù)FDA 染色原理，活細(xì)胞發(fā)出亮綠色熒光，若細(xì)胞熒光亮度降低說明細(xì)胞活性下降，不能很好地將FDA 水解為極性熒光素分子，將無綠色熒光的細(xì)胞記為死細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mg·L-1的NaAsO2對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞活性無明顯影響，0.3 ～10 mg·L-1的NaAsO2能致蠶豆氣孔保衛(wèi)細(xì)胞活性降低，且隨著NaAsO2濃度的升高細(xì)胞存活率逐漸下降，10 mg·L-1處理組存活率下降了28.4%(圖1)，濃度大于10 mg·L-1時(shí)，多數(shù)細(xì)胞熒光微弱，顯示細(xì)胞活性很低。

2.2 砷處理對(duì)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響

用ROS 熒光探針DCFH-DA 標(biāo)記后檢測發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組保衛(wèi)細(xì)胞具較弱的綠色熒光，3 與10 mg·L-1的NaAsO2處理組保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS 熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，即脅迫組胞內(nèi)ROS 水平升高(圖2)。由此可見，砷處理組細(xì)胞活性降低伴隨著胞內(nèi)ROS 水平的升高。

圖2 砷對(duì)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的影響Fig.2 Changes of relative intensity of ROS fluorescence in V.faba guard cell exposed to arsenic

為證實(shí)ROS 與細(xì)胞死亡的關(guān)系，用一定濃度的抗氧化劑AsA 或CAT 與NaAsO2共同作用，檢測ROS 水平降低后細(xì)胞死亡率的變化，發(fā)現(xiàn)2 種類型的抗氧化劑均可顯著抑制砷誘發(fā)的細(xì)胞死亡(圖3)。處理液中加入1 mmol·L-1的AsA 能抑制砷引起的細(xì)胞死亡，提高細(xì)胞存活率，使3 與10 mg·L-1NaAsO2處理組細(xì)胞存活率分別提高14.1%和23.5%;加入濃度為1 000 U·mL-1的CAT 同樣能夠顯著降低砷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率，使3 與10 mg·L-1NaAsO2組細(xì)胞存活率分別提高了15.4%和25.6%。研究結(jié)果表明，砷誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞死亡與脅迫過程中胞內(nèi)ROS 水平升高密切相關(guān)，ROS 參與介導(dǎo)了砷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。

圖3 抗氧化劑抗壞血酸(AsA)與過氧化氫酶(CAT)對(duì)砷致蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡的抑制作用Fig.3 Antagonistic effects of antioxidants(AsA and CAT)on As-induced guard cell death in V.faba

2.3 Ca2+和MAPK 參與砷誘發(fā)的細(xì)胞死亡

在砷處理液中加入一定濃度的Ca2+干擾劑降低胞內(nèi)Ca2+水平后，細(xì)胞存活率提高，死亡率下降(圖4)。處理液中加入的Ca2+特異性螯合劑EGTA 后，3 和10 mg·L-1NaAsO2組細(xì)胞存活率分別提高4.3%和15.9%，與砷單獨(dú)處理組相比均顯著增高(P ＜0.05);加入0.1 mmol·L-1的Ca2+通道抑制劑LaCl3后，3 和10 mg·L-1NaAsO2處理組細(xì)胞存活率分別提高了15.0%和24.6%，亦顯著高于砷單獨(dú)處理組(P ＜0.05)。這表明，砷誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞死亡與脅迫引發(fā)胞內(nèi)Ca2+水平升高有關(guān)，在胞內(nèi)Ca2+升高過程中胞外Ca2+內(nèi)流發(fā)揮了重要作用。

用0.1 mmol·L-1的MAPK 抑制劑PD98059 與NaAsO2共同處理蠶豆表皮條后，保衛(wèi)細(xì)胞存活率顯著高于砷單獨(dú)處理組(P ＜0.05)，3 mg·L-1砷處理組死亡率接近對(duì)照水平(圖5)，說明MAPK 參與了砷誘發(fā)的細(xì)胞死亡過程。

圖4 EGTA 與LaCl3對(duì)砷致蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡的抑制作用Fig.4 Antagonistic effects of EGTA and LaCl3 on As-induced guard cell death in V.faba

圖5 MAPK 抑制劑PD98059 對(duì)砷致蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡的抑制作用Fig.5 Antagonistic effect of MAPK inhibitor PD98059 on As-induced guard cell death in V.faba

3 討論(Discussion)

植物暴露于無機(jī)砷中會(huì)激發(fā)ROS 的產(chǎn)生，ROS具有很強(qiáng)的氧化能力，能直接破壞植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核苷酸、膜脂等生物大分子的結(jié)構(gòu)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[11]，ROS 還可作為信號(hào)分子介導(dǎo)多種生物學(xué)過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，NaAsO2處理誘發(fā)保衛(wèi)細(xì)胞死亡和胞內(nèi)ROS 水平升高同期發(fā)生。外源性給予ROS 清除劑AsA 和CAT 可降低非生物脅迫誘發(fā)的胞內(nèi)ROS 水平[8]，在NaAsO2處理液中加入AsA 或CAT后，NaAsO2誘發(fā)的細(xì)胞死亡被抑制，說明NaAsO2誘發(fā)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡與胞內(nèi)ROS 升高有關(guān)，砷脅迫下保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高介導(dǎo)了蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞的死亡。本結(jié)果為ROS 參與砷毒性作用過程提供了直接證據(jù)。

MAPK 途徑是氧化還原敏感的信號(hào)途徑，可受ROS 調(diào)節(jié)。特異性激酶抑制劑PD98059 能抑制MAPK 的激活[9]，從而阻斷MAPK 信號(hào)通路。本研究中加入MAPK 抑制劑PD98059 后能顯著抑制砷處理誘發(fā)的保衛(wèi)細(xì)胞死亡，表明MAPK 可能作為ROS 下游信號(hào)參與介導(dǎo)了砷誘導(dǎo)的蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡。

研究表明，脅迫產(chǎn)生的過量ROS 可激活質(zhì)膜Ca2+通道和胞內(nèi)Ca2+通透性離子通道，引起胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+水平升高[7,12-13]。Ca2+特異性螯合劑EGTA 能通過螯合作用降低細(xì)胞外Ca2+濃度從而有效阻止胞外Ca2+內(nèi)流;LaCl3作為Ca2+通道特異性抑制劑，能有效阻止胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞;因此，加入外源EGTA 或LaCl3能有效降低胞內(nèi)Ca2+[7]。本研究中，加入EGTA 或LaCl3后砷處理組細(xì)胞死亡率均顯著降低，說明胞內(nèi)Ca2+升高參與介導(dǎo)了砷誘發(fā)的細(xì)胞死亡，胞外Ca2+內(nèi)流是胞內(nèi)Ca2+升高的重要原因。因此，砷處理組蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高可能通過激活質(zhì)膜Ca2+通道，使胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+水平升高，從而激活相關(guān)下游信號(hào)引發(fā)細(xì)胞死亡。

胞質(zhì)中Ca2+超載可影響細(xì)胞核與線粒體內(nèi)的Ca2+水平，在Ca2+失衡的條件下基因表達(dá)、能量代謝、線粒體膜通透性等發(fā)生改變，可引發(fā)細(xì)胞壞死、凋亡、自噬性死亡[14]。細(xì)胞死亡信號(hào)途徑中有很多Ca2+靶標(biāo)，包括蛋白激酶、NO 合酶、核酸內(nèi)切酶、磷脂酶、蛋白磷酸化酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、蛋白酶等。

依據(jù)細(xì)胞毒性機(jī)制研究理論，結(jié)合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為，砷誘發(fā)植物細(xì)胞死亡可能通過下述3 條途徑:(1)脅迫產(chǎn)生的ROS 可直接攻擊DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子，使DNA 分子斷裂、修復(fù)酶活性降低，DNA 損傷無法及時(shí)修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[15];(2)ROS 激活質(zhì)膜Ca2+通道，使胞外Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+水平升高，進(jìn)而激活Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶，使細(xì)胞核DNA 在核小體連接處被切割，細(xì)胞凋亡;(3)胞內(nèi)ROS 和Ca2+水平升高使線粒體膜通透性破壞，細(xì)胞色素c、凋亡誘導(dǎo)因子釋放并于胞質(zhì)中形成凋亡復(fù)合體，激活類Caspase 蛋白酶，特異性切割下游底物，細(xì)胞凋亡[16-17]。雖然砷脅迫可能激活多種細(xì)胞死亡途徑，但本結(jié)果為細(xì)胞死亡的程序性調(diào)控提供了直接證據(jù)。

綜上所述，一定濃度的砷可誘發(fā)蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞死亡，砷脅迫誘發(fā)胞內(nèi)ROS 水平升高，ROS 激活質(zhì)膜Ca2+通道，使胞外Ca2+內(nèi)流，胞內(nèi)Ca2+水平升高，激活了胞內(nèi)Ca2+信號(hào)系統(tǒng)，Ca2+可激活細(xì)胞內(nèi)死亡相關(guān)基因表達(dá)執(zhí)行細(xì)胞死亡程序，引發(fā)細(xì)胞死亡。用植物細(xì)胞研究了砷毒性作用的信號(hào)途徑，該途徑與動(dòng)物細(xì)胞中報(bào)道的結(jié)果相似[18-19]，說明植物細(xì)胞在檢測環(huán)境有毒物質(zhì)的測試中同樣有效，而運(yùn)用蠶豆葉面氣孔保衛(wèi)細(xì)胞檢測環(huán)境化學(xué)物的細(xì)胞毒性，具有取材簡便、檢測靈敏快速、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因此，該方法可用于對(duì)環(huán)境化學(xué)物質(zhì)毒性作用的檢測和評(píng)價(jià)。

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