摘 要：驢由于役用功能減弱、養(yǎng)殖效益差等原因，近年來存欄數(shù)量驟減；同時受母畜季節(jié)性發(fā)情、生殖道結(jié)構(gòu)特殊、繁殖周期長等生理條件限制，驢精液冷凍研究及應用一直沒有系統(tǒng)展開。概述了國內(nèi)外驢精液采集、稀釋液的優(yōu)化、冷凍后精液品質(zhì)的評價及人工輸精等方面的技術(shù)應用。

關(guān)鍵詞：驢；精液冷凍；稀釋液；人工授精

中圖分類號 S85822 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）03-121-04

Application of Related Technology of Semen Freezing of Donkey

Zhang Ruitao1， 2 et al.

（1 Shandong Normal University， Ji’nan 250013，China； 2 Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Science， Ji’nan 250100，China）

Abstract：The living number of donkey has been dropping quickly in recent years， because of draft function abated， deficiency of breeding benefit. At the same time， semen freezing research and application of jack have not been launched on system， mainly due to season oestrus， special structure of genital tract of jenny， long reproduction cycle and confined by other physiological conditions. Based on the domestic and foreign research data， this review focuses on the application of semen acquisition， the optimization of diluent， the technology of semen quality evaluation and artificial insemination （AI）.

Key words：Donkey；Semen freezing；Diluent；Artificial insemination （AI）

歷史上驢一直是役用為主，肉、革、藥等綜合利用為輔。近年來由于農(nóng)業(yè)和運輸業(yè)的快速發(fā)展，驢在許多國家已經(jīng)逐漸退出役用及運輸工具的行列，導致驢的養(yǎng)殖規(guī)模日益縮小，存欄量以每年3.6%的速度遞減。據(jù)《中國農(nóng)村統(tǒng)計年鑒》公布的數(shù)據(jù)顯示，我國家驢正面臨著種質(zhì)資源逐步退化、驢群數(shù)量驟減和質(zhì)量逐漸降低的嚴峻形勢。自1798年Lazzaro Spallanzani等[1]成功實施人工授精試驗以來，在眾多科研工作者的努力下人工授精技術(shù)逐步完善，從試驗階段迅速走向?qū)嵱秒A段，目前已成為家畜改良和生產(chǎn)力提高的重要手段。另外精液冷凍和人工輸精在馬、羊等動物中的應用也非常廣泛，但其在驢中的應用非常有限。因而加大驢的人工繁殖技術(shù)研究力度，對未來提高驢的遺傳品質(zhì)、增加種群數(shù)量、避免驢品種滅絕均有重要意義。驢的人工授精包括精液采集、精液品質(zhì)評定、精液的處理及冷凍保存、輸精4個環(huán)節(jié)，筆者重點概述國內(nèi)外來在驢人工授精方面的最新研究成果。

1 精液采集

采精是人工授精的重要環(huán)節(jié)。國外對馬、驢采精多采用全自動采精儀分別收集射精各階段不同密度的精液[2]，進行精液品質(zhì)評價分析。國內(nèi)驢精液采集多用假陰道刺激收集。與牛相比，公驢、馬的睪丸及陰莖均較大，因而驢采精需要特制的假陰道，長度、內(nèi)徑均比牛用的要大許多；且公驢達到勃起及射精的性準備活動時間較長，約為5～30min；整個射精時間約為6～12s，射精量大約為10～110mL。采精前先裝好假陰道，假陰道內(nèi)加1.5～2L水（約為假陰道容積的1/2）[3]，水溫45～55℃（冬季采精水降溫快，夏季降溫慢，可根據(jù)環(huán)境溫度及驢采精時的反應適當調(diào)節(jié)水溫）。在接精杯口鋪4～6層紗布，將接精杯固定在假陰道的精液收集端。假陰道裝好后放到45℃恒溫箱中保溫。

讓公驢攀爬固定好的發(fā)情母驢或臺畜，刺激公驢興奮使其陰莖勃起。陰莖勃起后，采精員根據(jù)陰莖大小及公驢喜好調(diào)整假陰道壓力，右手托假陰道站在母驢右側(cè)，待公驢爬上母驢左手輕托陰莖，假陰道置于母驢生殖道位置將陰莖自然導入假陰道內(nèi)[3]。射精時公驢尾根抽動，待不抽動時射精完成，此時可排氣減壓使陰莖自然地縮出假陰道。豎起假陰道使精液完全濾到接精杯內(nèi)。每頭驢隔2～3d采集精液1次[4]。

2 冷凍保存液的優(yōu)化

精液冷凍過程中精子損傷主要有2種類型：氧化性損傷和物理性損傷[5]，因此精液冷凍保存技術(shù)的研究多數(shù)集中在如何降低氧化性損傷和物理性損傷兩方面。

2.1 氧化性損傷的降低 氧化性損傷主要是由于氧化應激引起的，是影響受孕率的一個主要因素[6]。氧化應激會導致精子損傷、畸形甚至引起雄性不育[6]。高濃度的活性氧會引起精子核酸磷酸化不足、脂質(zhì)過氧化、運動和存活能力下降等[6]，但低濃度的活性氧或?qū)⒒钚匝鯘舛瓤刂圃谝欢ǚ秶瑫拥恼Ｉ砉δ埽ū热缇荧@能、頂體反應和受精信號傳導等方面）維持起重要作用[7]。在精液貯藏用稀釋液中添加適量抗氧化劑或抗氧化劑酶能在精液冷凍時保證精子品質(zhì)不降低[6]。

維生素E能直接阻斷由亞鐵抗壞血酸引起的脂質(zhì)過氧化反應產(chǎn)生的自由基，比如過氧化氫、烷氧基，因此一直作為一種主要的抗氧化劑使用[8]。Mn2+能通過降低氧化應激來提高精子活性、存活時間、精子獲能和頂體反應[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)在冷凍稀釋液中分別添加維生素E及 Mn2+，能對牛、綿羊、山羊[7]、豬、犬和人的精子提供保護作用，并且能提高解凍后精子活力、膜完整性等精子品質(zhì)指標。

抗氧化劑酶也是一種天然的抗氧化劑，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶、谷胱甘肽（GPx）和谷胱甘肽還原酶（GR） ，它們能消除過量活性氧從而保護細胞結(jié)構(gòu)免受損傷。Bustamante Filho等[11]比較研究了馬的鮮精、脫脂奶-卵黃稀釋液稀釋的精液和解凍后的精液中過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和總抗氧化能力的活力變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鮮精中3種抗氧化劑酶活性顯著高于稀釋后的精液和解凍后的精液（P<0.01），但稀釋后的精液和解凍的精液中3種酶活性差異不顯著（P>0.05）。在離心去除精清中抗氧化酶的情況下，精液冷凍前后3種酶活性差異不顯著（P>0.05）。因而，上述實驗結(jié)果提示我們?nèi)缭隈R、驢冷凍精液制作過程中，在稀釋液中適量添加抗氧化酶，可彌補離心去除精清過程中損失的抗氧化酶，從而提高馬、驢冷凍精液解凍后的品質(zhì)。

2.2 物理性損傷的優(yōu)化 物理性損傷主要是由于細胞內(nèi)外形成冰晶造成的。一方面冰晶會破壞細胞結(jié)構(gòu)，另一方面局部結(jié)冰會使細胞內(nèi)滲透壓發(fā)生變化，對細胞造成損傷[12-13]。細胞冷凍時，首先在細胞外形成冰晶，在-10℃以上細胞內(nèi)仍不能結(jié)冰，當繼續(xù)降溫時，細胞外冰晶加快形成[12]。而在未結(jié)冰的水中，溶質(zhì)的濃度越來越高，這會使細胞內(nèi)過冷溶液和細胞外愈益變濃的溶質(zhì)之間的化學勢出現(xiàn)巨大差異。當降溫速率較慢時，細胞外的溶液中首先出現(xiàn)冰晶，細胞內(nèi)外出現(xiàn)化學勢差異，促使細胞內(nèi)的水分通過細胞膜向外滲出，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，產(chǎn)生細胞膜和胞內(nèi)蛋白損傷，即“溶質(zhì)損傷”[12-13]；而當降溫速率較快時，細胞內(nèi)部水分來不及外滲，就會出現(xiàn)胞內(nèi)冰晶網(wǎng)，對細胞膜造成機械損傷[14]。精液在降溫過程中0～60℃為有害溫度區(qū)域，因此在精液的冷凍過程中要盡快通過這個溫度危險區(qū)，才能獲得比較理想的冷凍效果。理論上馬、驢精液冷凍最佳降溫速度是36.5℃/min[12]。

細胞外冰晶的形成強烈地改變著細胞所處溶液的性質(zhì)，這種變化常稱為“溶液效應”。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因是冷凍時冰晶與溶質(zhì)分離。添加非電解質(zhì)，如甘油等，可明顯改變?nèi)芤盒?。Vidament等[15]報道在冷凍驢精液時添加2.2%、3.5%、4.8%的甘油，均影響受胎率，他們推測甘油可能對母驢的生殖道有毒性作用。近2年間我們課題組用含5.9%的甘油冷凍保存了50 000多份驢的精液，2012年在5個試驗基地共725頭驢和馬的配種試驗中，3個情期不返情率（受孕率）為53.11%，與鮮精配種結(jié)果相當。

3 精液品質(zhì)評價

精液品質(zhì)決定精液樣品的取舍和原精的稀釋倍數(shù)，現(xiàn)行精液品質(zhì)評定多從外觀評定、顯微鏡評定活力和生化檢查三方面進行。驢的原精活力70%～80%，高于馬；驢精液pH=7.6，明顯不同于牛、羊精液的pH=6.5～6.9。本節(jié)重點介紹精子活力、頂體完整性、線粒體活性、DNA完整性和精子膜完整性等實驗室評價技術(shù)[5]。

3.1 膜完整性檢測 質(zhì)膜是精子最外層的細胞結(jié)構(gòu)，對細胞內(nèi)外起著生理屏障作用，其完整性與精子正常的生理功能、新陳代謝、獲能、頂體反應、雄配子和雌配子的結(jié)合、精子與卵細胞的融合過程有著直接的聯(lián)系。有研究表明精子質(zhì)膜是最易損傷的部位，其完整性是精子死活的間接指標。檢測膜完整性較經(jīng)典的方法是Osinowo等發(fā)明的低滲腫脹測試法（HOST）。操作要點[16]：將精液用低滲溶液稀釋，37℃孵育后取混合均勻的樣品涂到37℃預熱的載玻片上，在400倍光學顯微鏡下觀察。膜完整的精細胞通過低滲腫脹測試后尾卷曲，膜不完整的精子不出現(xiàn)這種現(xiàn)象[28]。

3.2 線粒體活性檢測 線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，線粒體活性直接影響著精子的受精能力。精子線粒體活性可用羅丹明123（Rh123）染色的方法鑒定。羅丹明123是一種可以通過細胞膜、能染色活細胞線粒體的熒光染料，對細胞沒有毒性，僅幾分鐘就可和具有活性的線粒體結(jié)合，呈黃綠色熒光[17]。操作要點[16]：將羅丹明123溶于HEPES/BSA溶液中，取精液樣品加到羅丹明染液中，隨后置于潮濕黑暗的地方37℃孵育30min后取樣制片，400倍熒光顯微鏡觀察。

3.3 頂體完整性檢測 采用與異硫氰酸酯熒光素標記的花生凝集素（FITC—PNA）檢測頂體完整性[18]。操作要點[16]：取精子樣品涂片，風干后用甲醇固定再風干。將玻片浸沒在FITC—PNA溶液中。用PBS漂洗玻片，風干后涂一層防褪色溶液保護熒光，封片，熒光顯微鏡下觀察，頂體完整的精子細胞發(fā)出強熒光。

3.4 DNA完整性檢測 Evenson等科研工作者發(fā)明并改進了用染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）的方法來檢測精子DNA完整性[19-20]?；驹硎牵壕永鋬龊笫軗p傷的DNA會斷裂為單鏈，吖啶橙（AO）可與雙鏈DNA精子結(jié)合呈單體形式發(fā)出綠色熒光，而與單鏈DNA精子結(jié)合呈聚合物形式發(fā)出紅色或黃色熒光。檢測方法[16]：用TNE buffer稀釋精液樣品，低pH洗滌液洗30s，再用吖啶橙染色6min。蒸餾水漂洗后蓋上蓋玻片熒光顯微鏡下觀察。DNA完整的精子細胞發(fā)出綠色熒光，DNA鏈斷裂或單鏈DNA發(fā)出橘黃色、黃色、紅色熒光。

DNA完整性檢測還可以用單細胞凝膠電泳（SCGE）方法檢測。單細胞凝膠電泳技術(shù)由Ostling等首創(chuàng)，后經(jīng)Singh等[21]進一步完善而逐漸發(fā)展起來，是一種快速檢測單細胞DNA損傷的實驗方法，因其細胞電泳形狀頗似慧星，又稱慧星試驗（comet assay）。操作要點[22]：先用正常熔點瓊脂糖制備第1層膠，再將稀釋精液樣品、低熔點瓊脂糖涂于第1層膠上，然后分別用裂解液、RNase和蛋白酶K消化處理，電泳、染色，400倍熒光顯微鏡下觀察。 DNA斷裂的細胞會形成彗星樣條帶，DNA完整的精細胞則不會出現(xiàn)這種情況。Rahul等[23]用SCGE法分析冬季和夏季精子冷凍前與冷凍后DNA完整性，發(fā)現(xiàn)水牛精子冷凍后DNA損傷程度高（P<0.05）；同時發(fā)現(xiàn)夏季DNA損傷程度顯著高于冬季（P<0.05）。Fraser等[40]用SCGE法檢測豬精子DNA完整性，發(fā)現(xiàn)冷凍-解凍可引起精子DNA片段化程度增高（P<0.05），而與采精方法及使用的凍存液類型無關(guān)。

雖然驢精液凍存研究較少，相關(guān)檢測方法在驢中也未見相關(guān)報道，但鑒于精子這5種凍后指標檢測方法在人、牛、豬等物種中都有相關(guān)應用[15，22，24]，因此推測在驢精子凍存檢測中也是適用的。

4 人工輸精技術(shù)

與其他家畜相比，馬和驢人工授精技術(shù)發(fā)展相對緩慢，主要原因一是缺乏繁殖記錄，對驢排卵機制認知有限。驢發(fā)情周期大約20～40d，多數(shù)品種在23～30d，發(fā)情持續(xù)6～9d，其中發(fā)情5～6d后才排卵；二是對此的認同度不高[25]，馬及驢的本交或人工授精在1個發(fā)情周期中大約要進行2～4次，顯著不同于牛的人工輸精；三是在馬和驢人工輸精過程中出現(xiàn)了其他物種不存在的技術(shù)障礙，如母驢的子宮頸通常比母馬長，且子宮頸口直徑較小[25]。但驢和馬有一定的經(jīng)濟價值，且人工授精技術(shù)在大規(guī)模飼養(yǎng)條件下可較大程度上降低養(yǎng)殖成本、減少疫病傳播、提高優(yōu)良種質(zhì)利用效率、選擇最佳的配種時機等，因而有必要形成一套有效的人工輔助繁殖技術(shù)[25]。

馬低劑量人工輸精經(jīng)常采用子宮頸深部授精的方式，即用導管將精液輸送到與卵巢卵泡發(fā)育同側(cè)的近輸卵管乳突部，此方法在精子數(shù)量有限的條件下能有效提高受精率[27-28]。目前常用的有直腸引導深角授精技術(shù)（TRG）和宮腔鏡深角授精技術(shù)（HYS）2種方式。宮腔鏡深角授精使得授精位置準確，但宮腔鏡設(shè)備昂貴[29]，且子宮內(nèi)窺鏡檢測和相關(guān)的空氣擴張子宮可能引起細菌滋生造成子宮內(nèi)膜炎[30]，也會降低受孕率。采用一次性授精管通過直腸引導的方式將精液輸送到近輸卵管乳突部的方法可替代宮腔鏡授精方法[31]。

19卷03期張瑞濤等 驢精液采集與冷凍相關(guān)技術(shù)研究TRG操作要點[16，19]：吸取精液，手拿導管經(jīng)產(chǎn)道穿過子宮頸，然后將手臂撤出產(chǎn)道插入直腸，經(jīng)直腸引導輸精管到達與卵泡發(fā)育的卵巢同側(cè)的子宮角頂部。通過觸診的方式確認輸精管末端到達子宮角頂端，推動注射器慢慢將精液緩緩注入子宮腔內(nèi)。拔下注射器吸取3mL空氣接到輸精管上緩緩壓到輸精管中，確保精液完全排出輸精管。輸精結(jié)束3min后再讓驢走動。HYS操作要點[29]：與直腸引導輸精技術(shù)相似，手拿可彎曲的內(nèi)窺鏡進入產(chǎn)道穿過子宮頸。撤出手臂插入到直腸中，通過直腸引導內(nèi)窺鏡到與卵泡發(fā)育的卵巢同側(cè)的子宮角中。向子宮角末端充氣，使內(nèi)窺鏡前行，直至看到輸卵管乳頭。內(nèi)部輸精管前行到接近輸卵管乳頭，此時將精液全部排到乳頭內(nèi)。將輸精管撤出，將內(nèi)窺鏡撤到子宮角底排除子宮內(nèi)的空氣，最后將內(nèi)窺鏡撤出。

對比2種授精方式，Lindsey等[33]認為HYS（5/10，50%）比TRG（0/10，0%）受孕率高，但Brinsko等[32]認為HYS（12/18，66%）和TRG（10/18，56%）2種授精方式受孕率差異不顯著，后來Lindsey等[34]研究發(fā)現(xiàn)HYS（12/22，）和TRG（9/24）2種授精方式對受孕率影響不顯著。Hayden 等[29]進一步研究發(fā)現(xiàn)：輸精量足夠時2種授精方式對受孕率影響不大，但當輸精量在25×106～50×106時明顯影響受孕率，因而建議用凍存精液或性控篩選精液配種時需采用深角輸精法。

參考文獻

[1]Pacey A.A， Tomlinson J.M. Sperm Banking： Theory and Practice [M].Cambridge University， Cambridge University Press， 2009.

[2]Kareskoski A.M.， Reilas T.， Andersson M. Motility and plasma merebrance integrity of spermatozoa in fractionated stallion ejaculates after storage [J]. Reprod Domest Anim，2006， 41（1）：33-38.

[3]曾維斌，王艷萍. 馬、驢精液保存研究進展 [J]. 中國食草動物，2009，29 （4）：59-62.

[4]Gastal M.O.， Henry M.， Beker A.R. et.al. Effect of ejaculation frequency and season on donkey jack semen [J]. Thenogenology， 1997， 47（3）：627-638.

[5]Squires E.L. Integration of future biotechnologies into the equine industry [J]. Animal Reproduction Science， 2005， 89（1-4）： 187-198.

[6]Bansal A.K.， Bilaspuri G.S. Impacts of Oxidative Stress and Antioxidants on Semen Functions[J]. Veterinary Medicine International，2011.

[7]Bucak M.N.， Sari zkan S.， Tuncer P.B. et al. The effect of antioxidants on post-thawed Angora goat （Capra hircus ancryrensis） sperm parameters， lipid peroxidation and antioxidant activities [J]. Small Ruminant Research，2010， 89（1）：24-30.

[8]Bansal A.K.， Bilaspuri G.S. Antioxidant effect of vitamin E on motility， viability and lipid peroxidation of cattle spermatozoa under oxidative stress [J]. Animal Science Papers and Reports，2009， 27（1）：5-14.

[9]Bansal A.K.， Bilaspuri G.S. Effect of manganese on bovine sperm motility， viability， and lipid peroxidation in vitro [J]. Animal Reproduction CBRA，2008， 5（3-4）：90-96.

[10]Bilaspuri G.S.， Bansal A.K. Mn2+： a potent antioxidant and stimulator of sperm capacitation and acrosome reaction in crossbred cattle bulls [J]. Archiv fur Tierzucht，2008， 51（2）：149-156.

[11]Bustamante F.I.C.， Pederzolli C.D.， Sgaravatt A.M. et al. Skim milk-egg yolk based semen extender compensates for non-enzymatic antioxidant activity loss during equine semen cryopreservation [J]. Anim. Reprod， 2009， 6（2）：392-399.

[12]董偉. 家畜精子和胚胎的冷凍保存[C]第九屆國際家畜繁殖會議論文綜述（二），1981，6：38-42.

[13]楊戈爾， 張愛麗， 徐學敏，等. 胞內(nèi)冰晶形成（綜述）[J]. 工程熱物理學報，2007，28（S2）：55-57.

[14]Acker J.P.， Mcgann L.E. Membrane Damage Occurs During the Formation of Intracellular Ice [J]. Cryo-Letters， 2001， 22（4）：124-254.

[15]Vidament M.， Vincent F.X.， Magistrini M. et al. Differences in ability of jennies and mares to conceive with cooled and frozen semen containing glycerol or not [J]. Animal Reproduction Science，2009， 112（1-2）：22-35.

[16]Hu J.H.，Li Q.W.，Zan L.S. et al. The cryoprotective effect of low-density lipoproteins in extenders on bull spermatozoa following freezing-thawing [J]. Animal Reproduction Science，2010 ， 117（1-2）：11-17.

[17]Garner D.L.， Thomas C.A.， Joerg H.W. et al. Fluorometric assessments of mitochondrial function and viability in cryopreserved bull spermatozoa [J]. Biol. Reprod.，1997， 57（6）： 1 401-1 406.

[18]Aboagla E.M.， Terada T. Trehalose-enhanced fluidity of the goat sperm membrane and its protection during freezing [J]. Biol. Reprod，2003， 69（4）：1 245-1 250.

[19]Evenson D.P.， Darzynkiewicz Z.， Melamed M.R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility [J]. Science 1980， 210（4 474）： 1 131-1 133.

[20]Evenson D.P.， Larson K.L.， Jost L.K.. Sperm chromatin structure assay： its clinical use for detecting sperm DNA fragmentation in male infertility and comparisons with other techniques[J]. Androl，2002， 23（1）： 25-43.

[21]Duty S.M.， Singh N.P.， Ryan I. et al. Reliability of the comet assay in cryopreserved human sperm [J]. Hum. Reprod，2002， 17（5）：1 274-1 280.

[22]Hu J.H.，Li Q.W.，Jiang Z.L，et al. Effects of different extenders on DNA integrity of boar spermatozoa following freezing-thawing [J]. Cryobiology，2008， 57（3）：257-262.

[23]Rahul N.， Haresh D.， Chaitanya J. Evaluation of buffalo bull spermatozoal and DNA damage useing single cell gel electrophoresis [J]. International Journal of Life science Pharma Research，2011， 1（1）： 38-43.

[24]Lechniak D.， Kedzierski A.， Stanislawski D. The Use of HOS Test to Evaluate Membrane Functionality of Boar Sperm Capacitated in vitro [J]. Reproduction in Domestic Animals，2002， 37（6）：379-380.

[25]Angus O. McKinnon， Edward L. Squires Equine Reproduction [M]. Edition 2Wiley-Blackwell， 2011.

[26]Varner D.D.， Love C.C.， Brinsko S.P. et al. Semen processing for the subfertile stallion[J]. Equine Vet Sci，2008， 28（11）：677- 685.

[27]Varner D.D.， Love C.C.， Blanchard T.L. et al. Breeding-management strategies and semen-handling techniques for stallions-case scenarios [J]. Proc 56th Ann Conv Amer Assoc Equine Pract，2010， 56（4-8）： 215-226.

[28]Morris L.H.A， Tiplady C.， Allen W.R. Pregnancy rates in mares after a single fixed time hysteroscopic insemination of low numbers of frozen-thawed spermatozoa onto the uterotubal junction [J]. Equine Vet Sci，2003， 35（2）：197-201.

[29]Hayden S.S.， Blanchard T.L.， Brinsko S.P. et al. Pregnancy rates in mares inseminated with 0.5 or 1 million sperm using hysteroscopic or transrectally guided deep-horn insemination techniques [J]. Theriogenology， 2012， 78（4）： 914-920.

[30]Schiemann V.， Bartmann C.P.， Kirpal G. et al. Diagnostic hysteroscopy in the mare - uterine contamination and endometrial reaction [J]. Pferdeheilkunde，2001， 17（6）：557- 564.

[31]Samper J.C.， Gomez I.， Sanchez R. Rectally guided or hysteroscopic insemination： is there a difference？ [J]. Equine Vet Sci，2008， 28（11）：640 - 644.

[32]Brinsko S.P.， Rigby， S.L. Lindsey A.C. et al. Pregnancy rates in mares following hysteroscopic or transrectally-guided insemination with low sperm numbers at the utero-tubal papilla [J]. Theriogenology，2003， 59（3）：1 001-1 009.

[33]Lindsey A.C.， Morris L.H.A.， Allen W.R. et al. Hysteroscopic insemination of mares with low numbers of nonsorted or flow sorted spermatozoa [J]. Equine Vet J，2002， 34（2）：128 -132.

[34]Lindsey A.C.， Varner D.D.， Seidel G.E.J. et al. Hysteroscopic or rectally guided， deep-uterine insemination of mares with spermatozoa stored 18 h at either 5 degrees C or 15 degrees C prior to flow-cytometric sorting [J]. Anim Reprod Sci， 2005， 85（58）：125-130.

（責編：徐世紅）