摘 要：利用谷子基因組序列開發(fā)出SSR引物205對，其中171對可以穩(wěn)定擴增出目的條帶，149對有多態(tài)性。利用30個多態(tài)性SSR標(biāo)記對41份谷子種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，共檢測出291個等位變異，平均每個位點9.7個。谷子地方品種基因多樣性指數(shù)平均為0.7907，育成品種基因多樣性指數(shù)平均為0.7571。對41個谷子品種進行聚類，在遺傳相似系數(shù)為0.164時聚為6組，與生態(tài)型基本一致。

關(guān)鍵詞：谷子；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性；聚類分析

中圖分類號：S515.032文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）03-0033-07

谷子[Setaria italica （L.） Beauv.]起源于我國，是世界上最古老的糧食作物之一[1]。谷子具有耐旱、耐鹽、耐瘠薄、高光合作用效率等特性，在我國北方旱作農(nóng)業(yè)和食品消費多元化需求方面占有重要地位。谷子是二倍體自花授粉作物， 基因組較小，約490 Mb，與水稻基因組結(jié)構(gòu)存在明顯的共線性，是進行基因組研究的理想作物[2]。近年來，基于DNA序列所開發(fā)的RFLP、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記的發(fā)展為谷子的遺傳研究提供了有力工具[3～5]。SSR標(biāo)記具有分析簡便、重復(fù)性好、多態(tài)性高等優(yōu)點，是谷子遺傳多樣性、品種鑒定和QTL定位等研究的有效標(biāo)記[6]。然而現(xiàn)有的谷子SSR標(biāo)記數(shù)量少，不能滿足谷子多方面研究的需要，大量開發(fā)覆蓋全基因組的SSR標(biāo)記仍是目前谷子研究的重要工作之一。本研究通過對谷子基因組序列進行SSR位點的搜索，開發(fā)出一批SSR標(biāo)記，對一批不同生態(tài)類型的谷子種質(zhì)資源進行了初步的遺傳多樣性研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從谷子核心種質(zhì)材料中選取41份有代表性的地方品種和育成品種，共涉及東北平原、華北平原、淮河以南、黃土高原、內(nèi)蒙古高原及西北內(nèi)陸6個生態(tài)區(qū)（表1）。將這些材料發(fā)芽培養(yǎng)，兩葉一心期時，采用CTAB法[7]提取DNA。

1.2 SSR標(biāo)記開發(fā)

從數(shù)據(jù)庫Phytozome下載谷子基因組序列，利用SSRHunter 1.3軟件[8]進行SSR位點的搜索，設(shè)置重復(fù)次數(shù)至少為5、構(gòu)成重復(fù)基元的核苷酸數(shù)最多是6個。選取重復(fù)次數(shù)在20以上或者重復(fù)堿基數(shù)在40個以上的SSR位點，利用重復(fù)序列兩端的保守側(cè)翼序列，用Primer 5.0設(shè)計引物。引物設(shè)計的條件是：PCR產(chǎn)物長度為100～350 bp；退火溫度（Tm）為50～70℃，保證兩引物間Tm值相差不超過4℃；GC（%）含量為40%～65%；引物長度為18～28 bp。為了保證引物的特異性，用于設(shè)計引物的保守側(cè)翼序列與微衛(wèi)星位點至少間隔20～30個堿基。引物設(shè)計后由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 PCR擴增及等位變異檢測

PCR體系（12.5 μl）包括10×Taq Buffer 1.25 μl，25 mmol/L Mg2+0.75 μl，10 mmol/L dNTP0.3125 μl，上下游引物（5 μmol/L）各1μl，0.5單位Taq酶和DNA模板20～50 ng。PCR程序為：94℃預(yù)變性4 min；94℃ 45 s，退火溫度45 s，72℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.4 遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析

根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物的遷移率記錄結(jié)果，遷移率最大（分子量最?。┑臈l帶記為1，遷移率次之的記為2，依次類推，無條帶記為0，建立供試材料SSR基因型信息數(shù)據(jù)庫。利用PowerMarker V 3.25[9]計算引物的等位基因數(shù)（Na）、基因多樣性指數(shù)（He）。利用NTSYSpc V 2.10e[10]計算品種間的遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進行聚類分析，繪制樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物開發(fā)

利用Phytozome數(shù)據(jù)庫提供的谷子基因組序列，共設(shè)計出205對引物，其中171對引物能夠擴增出穩(wěn)定的目的條帶，149對引物表現(xiàn)出多態(tài)性。

2.2 遺傳多樣性分析

選取均勻分布在谷子基因組中的30個多態(tài)性標(biāo)記，對41份谷子種質(zhì)資源進行分析。30對引物共檢測到291個等位變異，每個位點檢測出的等位變異數(shù)為4～16個，平均每個位點9.7個。其中，地方品種和育成品種檢測到的等位變異數(shù)分別為8.5和6.5個。地方品種基因多樣性指數(shù)為0.5728～0.8926，平均為0.7907，育成品種基因多樣性指數(shù)為0.5455～0.8750，平均為0.7571，谷子地方品種遺傳多樣性高于育成品種（表2）。分析各生態(tài)區(qū)資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)東北平原品種基因多樣性指數(shù)最高，其次是華北平原，淮河以南的最低（表3）。圖1為引物S226在41份谷子品種中檢測到的多態(tài)性。

2.3 谷子品種聚類分析

利用NTSYS軟件計算出的41份谷子品種間遺傳相似系數(shù)（GS）值變動于0.0328～0.5614之間。其中來自遼寧的紅苗老來變和山東的魯谷5號、河南的繩頭黃谷和張家口的壩低1之間的遺傳相似系數(shù)最小，為0.0328，表明它們之間的親緣關(guān)系最遠；來自河北的冀谷20和山東的魯谷5號之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.5614，說明其親緣關(guān)系最近。

對41個谷子品種進行聚類分析（圖2），當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.14時，所有品種可以聚成兩大

組。第一組主要是來自黃土高原、西北內(nèi)陸和內(nèi)蒙高原的材料，第二組主要是來自華北平原和東北平原的材料。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.164時，所有品種可以分成六組：第一組包括黑龍江的老來變和黑谷2號，甘肅的永昌小白谷；第二組包括11個材料，分別是吉林的鴨子嘴、長擴1，河北的鴨子嘴，雁北的早二白谷，張家口的二黃米，山西的腰谷、爬坡糙，陜西的老來變，寧夏的狼尾巴，青海的黃袍谷，新疆的吐魯番谷子，代表了內(nèi)蒙高原、黃土高原和西北內(nèi)陸生態(tài)區(qū)。第三組是四份育成品種，分別是嫩選15、壩低1、隴谷5號和大涼州谷。第四組是山西的紅桿谷、內(nèi)蒙古的金香玉以及3份育成品種。第五組包括17份材料，其中7份來源于華北平原，3份來源于東北平原，2份來源于淮河以南。第六組為河北的黑谷。聚類分析表明，來自同一生態(tài)區(qū)的谷子品種基本聚合在一起。

圖2 41份谷子種質(zhì)資源的聚類分析

3 討論 Jia等（2009）[11]用（GA）n和（CA）n兩個富集文庫開發(fā)出269對谷子SSR引物。Li等（2008）[12]建立了 （AC）15、（AT）15、（AG）12、（TG）12和（TC）12 5個微衛(wèi)星文庫，設(shè)計了393對引物。Jia等（2007）[6]從1 213條EST序列中搜索到30個SSR位點，設(shè)計出26對引物。本研究直接利用谷子基因組序列開發(fā)的SSR引物，可以更全面地反映谷子DNA水平上的遺傳變異。與EST-SSR相比，基因組SSR 引物多態(tài)率高，等位變異豐富，可以有效應(yīng)用于谷子品種鑒定和遺傳多樣性研究。

本研究用30個多態(tài)性SSR標(biāo)記在41份谷子初級核心種質(zhì)中檢測到291個等位變異，每個位點4～16個，平均9.7個，每個位點的基因多樣性指數(shù)在0.6151～0.8977之間，平均為0.8074，表明本研究開發(fā)的引物能夠揭示豐富的等位基因變異。此結(jié)果與Ma等（2007）[13]的研究結(jié)果不一致，與Wang等（2012）[14]的研究結(jié)果相似，原因可能是本研究利用的是谷子初級核心種質(zhì)，選材更具代表性，因此可以全面反映谷子種質(zhì)資源的多樣性。地方品種和育成品種檢測到的等位變異數(shù)分別為8.5個和6.5個，地方品種基因多樣性指數(shù)為0.5728～0.8926，平均為0.7907，育成品種基因多樣性指數(shù)為0.5455～0.8750，平均為0.7571，谷子地方品種遺傳多樣性高于育成品種。利用NTSYS計算41份谷子品種間的遺傳相似系數(shù)，并進行聚類分析，多數(shù)材料遺傳相似系數(shù)較小，表明我國有豐富的谷子資源類型，有很高的育種潛力。