摘 要：以歐麗特菠菜葉片為試材，研究了菠菜葉片發(fā)育過(guò)程中3個(gè)時(shí)期葉片（幼葉、成熟葉、衰老葉）的抗壞血酸代謝變化及抗壞血酸含量與其相關(guān)酶活性的關(guān)系。結(jié)果表明：抗壞血酸（AsA）和氧化型抗壞血酸（DHA）含量的變化趨勢(shì)與L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）以及脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）活性的變化趨勢(shì)基本一致，而與抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性變化呈此消彼長(zhǎng)。同時(shí)單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）和還原型谷胱甘肽（GSH）有助于AsA的再生。說(shuō)明通過(guò)增加GalLDH和再生酶活性能提高菠菜葉片AsA的含量，并延緩其衰老。

關(guān)鍵詞：菠菜； 葉片； 抗壞血酸；循環(huán)； L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶

中圖分類號(hào)：S636.101文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）03-0064-04

抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）是植物和大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)合成的一類己糖內(nèi)酯化合物，是大多數(shù)生物體內(nèi)重要的抗氧化劑和許多酶的輔因子，在生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用（Noctor Foyer，1998）。在高等植物中，AsA除了通過(guò)AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)再生外，還可以自身合成。脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR） 、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）及谷胱甘肽還原酶（GR） 是參與AsA-GSH循環(huán)的主要酶。而L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）是AsA自身合成主要途徑即L-半乳糖途徑中直接催化半乳糖內(nèi)酯的關(guān)鍵酶。關(guān)于植物發(fā)育過(guò)程中AsA通過(guò)AsA-GSH循環(huán)再生及合成的研究，國(guó)內(nèi)外系統(tǒng)報(bào)告尚少。本試驗(yàn)以菠菜品種歐麗特的葉片為試材，探討了菠菜葉片發(fā)育過(guò)程中AsA-GSH循環(huán)及AsA合成關(guān)鍵酶GalLDH活性的變化，以明確菠菜葉片發(fā)育對(duì)抗壞血代謝的影響及抗壞血酸含量與其相關(guān)酶活性的關(guān)系，為調(diào)控菠菜的AsA含量的栽培和育種，延緩菠菜衰老提供理論依據(jù)。

1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料

以菠菜歐麗特（Spinacia oleracea L.）葉片為試材，2012年3月下旬種植于聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地，于4月下旬隨機(jī)采取菠菜發(fā)育過(guò)程中3個(gè)時(shí)期的葉片（幼葉為出苗后第30天，新長(zhǎng)成的4片葉；成熟葉為出苗后第40天，由內(nèi)向外第3～5片葉；衰老葉為出苗后第50天，由內(nèi)向外第5～7片葉）若干，用液氮處理并保存于-80℃待用。每個(gè)樣品在田間分別隨機(jī)3點(diǎn)取樣。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及研究方法

1.2.1 還原型抗壞血酸（AsA）和氧化型抗壞血酸（DHA）測(cè)定 參考Turcsanyi等及Takahama和Oniki提供的方法并做適當(dāng)改進(jìn)[3，4]。

1.2.2 還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）測(cè)定 參考Michael等提供的方法。

1.2.3 L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶（GalLDH）活性的測(cè)定 參照Tabata等（2001）[5]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)。1個(gè)酶活性單位定義為每分鐘氧化1 nmol L-半乳糖內(nèi)酯（相當(dāng)于還原2 nmol 細(xì)胞色素C）所需的酶液量，并把它換算用U/gFW表示。其中摩爾系數(shù)值為17.3 L/（mol·cm），用于酶活性計(jì)算。

1.2.4 DHAR、MDHAR和APX活性的測(cè)定 參考Stasolla和Yeung提供的方法[6]。DHAR 1個(gè)酶活性單位（U/gFW）定義為每克鮮重每分鐘還原1 μmol DHA；MDHAR 1個(gè)酶活性單位（U/gFW）定義為每克鮮重每分鐘氧化1 μmol NADH；APX 1個(gè)酶活性單位（U/gFW）定義為每克鮮重每分鐘氧化1 μmol AsA。

1.2.5 谷胱甘肽還原酶（GR）活性的測(cè)定 按Knorzer 等（1996）[7]的方法，這是基于NADPH 氧化后在340 nm 處的吸光度的減少來(lái)衡量酶活性大小的方法。

各項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜葉片發(fā)育過(guò)程中AsA、DHA、AsA+DHA含量和AsA/DHA比值的變化

由圖1可以看出，在幼葉、成熟葉和衰老葉中AsA、DHA和AsA+DHA含量差異顯著。AsA和AsA+DHA含量隨著葉片的發(fā)育逐漸升高，至葉片成熟后，隨葉片的衰老顯著降低，呈先升高后降低趨勢(shì)。而DHA含量在葉片發(fā)育進(jìn)程中一直呈降低趨勢(shì)。

由圖2看出，菠菜葉片發(fā)育過(guò)程中AsA/DHA比值先升高后降低。在葉片成熟以前升高，成熟后隨著葉片的衰老AsA/DHA比值顯著降低。說(shuō)明AsA氧化還原狀態(tài)與葉片的衰老密切相關(guān)。

2.2 菠菜葉片發(fā)育過(guò)程中GSH、GSSG、總谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量和GSH/GSSG比值的變化

GSH是植物體內(nèi)一個(gè)重要的抗氧化劑和氧化還原勢(shì)的調(diào)節(jié)劑，作為DHA的電子供體，其氧化還原態(tài)是通過(guò)AsA-GSH循環(huán)來(lái)與AsA聯(lián)系[8]。由圖3看出，菠菜葉片中GSH含量隨著其生長(zhǎng)進(jìn)程逐漸降低，在幼葉含量最高，在衰老葉含量最低；GSSG先升高后降低，在成熟葉中含量最高，成熟后隨著葉片的衰老GSSG含量顯著降低；總谷胱甘肽（GSH+GSSG）含量先升高后降低，在成熟葉中含量最高，在衰老葉中顯著降低。

反映谷胱甘肽氧化還原狀態(tài)的GSH/GSSG比值在幼葉中最高，隨著葉片的生長(zhǎng)顯著降低，到衰老時(shí)又有所升高（圖4）。