摘要：分別采用親本和雜交種為材料，從４４對(duì)引物中篩選出適合于鑒定兩系雜交水稻品種兩優(yōu)１７、苯兩優(yōu)６３９、天兩優(yōu)６１６的引物。結(jié)果表明，對(duì)同一品種用兩種方法篩選出的ＳＳＲ引物相同。在沒有親本的情況下，僅用雜交種篩選得到的引物可用于室內(nèi)純度鑒定。

關(guān)鍵詞：兩系雜交稻；ＳＳＲ；純度鑒定；引物篩選

中圖分類號(hào)：Ｑ７８９∶Ｓ５１１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）10－1965-03

運(yùn)用ＳＳＲ檢測(cè)水稻種子純度，以往的研究與應(yīng)用一般都是用親本種子來篩選引物［１－８］。通常情況下，種子經(jīng)銷商沒有掌握親本種子，生產(chǎn)商由于某種原因又不愿意提供親本種子用于種子檢驗(yàn)。在這種情況下，如能直接利用商品兩系雜交種子篩選ＳＳＲ引物，則可為兩系雜交種子質(zhì)量監(jiān)督帶來方便。劉衛(wèi)今等［９］曾在無親本種子的條件下，用三系雜交水稻Ｆ１種子篩選引物進(jìn)行純度鑒定。但兩系雜交種子這方面的問題前人研究甚少［１０－１２］，尤其是采用室內(nèi)與室外大群體比對(duì)的研究尚未見諸報(bào)道。研究的目的在于比較用親本種子篩選的引物與用雜交種篩選的引物是否具有一致性，用這些引物鑒別親本雜株是否具有可靠性，從而進(jìn)一步判斷用雜交種篩選出的ＳＳＲ引物能否替代用親本種子篩選出的ＳＳＲ引物，以提高引物篩選效率，降低檢測(cè)難度與成本。

１材料與方法

１．１材料

試驗(yàn)所用品種天兩優(yōu)６１６、兩優(yōu)１７、苯兩優(yōu)６３９及其親本均由湖北省種子管理局提供。所用引物及試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

１．２方法

１．２．１田間鑒定以上所有品種都設(shè)置田間正季鑒定，每品種一個(gè)小區(qū)，每小區(qū)５０行，編號(hào)為１~５０；每行１０株，編號(hào)為１~１０，共５００株，每株代號(hào)為４位數(shù)，前兩位表示行序號(hào)，后兩位數(shù)表示同一行的株序號(hào)，例如２９０８表示第２９行第８株。株距１７ｃｍ，行距２７ｃｍ。在各小區(qū)前端種植該樣品的不育系和恢復(fù)系各兩行（２０株），作為ＳＳＲ和田間雜株比對(duì)標(biāo)樣。鑒定方法根據(jù)ＧＢ／Ｔ ３５４３．５—１９９５執(zhí)行。

１．２．２ＰＣＲ反應(yīng)體系ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)總體積１０μL：１０×ｂｕｆｆｅｒ １μL，１０ｍmol/L ｄＮＴＰ ０．２μL，５０ｎｇ／μL ｐｒｉｍｅｒ ０．２μL＋０．２μL，２U／μL Ｔａｑ酶０．６μL，２５ｎｇ／μL ＤＮＡ １μL，ｄｄＨ２Ｏ ６．８μL。ＰＣＲ反應(yīng)條件為：９４℃預(yù)變性４ｍｉｎ；９４℃、１５ｓ，５５℃、１５ｓ，７２℃、３０ｓ，３５個(gè)循環(huán)；最后在７２℃下延伸７ｍｉｎ。擴(kuò)增產(chǎn)物在含ＥＢ的３％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

１．２．３ＤＮＡ模板制備和引物篩選ＤＮＡ模板的制備采用農(nóng)業(yè)部推薦的簡(jiǎn)易法。試驗(yàn)采用１０個(gè)單株幼苗抽提的ＤＮＡ混合物做模板，以消除雜株可能對(duì)篩選結(jié)果的干擾。然后用農(nóng)業(yè)部推薦的兩系雜交稻種子適用的４４對(duì)ＳＳＲ引物分別對(duì)兩優(yōu)１７、苯兩優(yōu)６３９、天兩優(yōu)６１６及其不育系、恢復(fù)系ＤＮＡ進(jìn)行擴(kuò)增，從中篩選出多態(tài)性高、共顯性強(qiáng)、譜帶清晰，分別適合以上３個(gè)品種純度鑒定的引物。

１．２．４純度結(jié)果比對(duì)室內(nèi)鑒定樣品為移栽２０ d后的秧苗，將全部５００株按植株編號(hào)逐株剪取雜交種及親本倒數(shù)第二葉，用于ＳＳＲ室內(nèi)純度檢測(cè)。在齊穗期前后，分兩次進(jìn)行田間純度鑒定，并與ＳＳＲ純度鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。將室內(nèi)與室外兩種方法鑒定的所有雜株，再次抽樣進(jìn)行室內(nèi)ＳＳＲ確認(rèn)。

２結(jié)果與分析

２．１３個(gè)品種兩種方法的引物篩選結(jié)果

試驗(yàn)分別用兩優(yōu)１７、苯兩優(yōu)639、天兩優(yōu)６１６的親本和雜交種做材料，進(jìn)行引物篩選。結(jié)果表明，在農(nóng)業(yè)部推薦的４４對(duì)引物中，每個(gè)品種用兩種材料都可篩選出多對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)雙親互補(bǔ)帶型，多態(tài)性明顯。試驗(yàn)從中分別優(yōu)選出能夠區(qū)分雜交種和親本的引物３~４對(duì)，篩選結(jié)果見表１。

由表１可知，用雜交種篩選的引物與用親本種子篩選的引物完全一致，這些ＳＳＲ引物都能區(qū)分出父母本雜株。如果受檢樣品中混雜的雜株全部是親本種子，用雜交種子篩選出的ＳＳＲ引物與用親本種子篩選的ＳＳＲ引物對(duì)同一份兩系雜交稻種子樣品做純度鑒定，應(yīng)該可以得到一致的結(jié)果。不同的品種篩選出的適用引物可能相同。用兩種材料篩選的引物中，ＲＭ１７可用于兩優(yōu)１７、苯兩優(yōu)６３９、天兩優(yōu)６１６ 三個(gè)品種的純度檢測(cè)；ＲＭ２６３可用于苯兩優(yōu)６３９、天兩優(yōu)６１６兩個(gè)品種的純度檢測(cè)。

２．２樣品不育系、恢復(fù)系雜株田間與室內(nèi)ＳＳＲ譜帶對(duì)比

由表２可知，田間表現(xiàn)為真實(shí)的恢復(fù)系和不育系類型的雜株，與室內(nèi)對(duì)應(yīng)編號(hào)植株的ＳＳＲ譜帶特征具有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。田間鑒定圃中，親本和雜交種子的形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)特性與原品種相符，3個(gè)品種間差異明顯。通過田間與室內(nèi)比對(duì)發(fā)現(xiàn)雖然室內(nèi)鑒定的不育系與恢復(fù)系與田間并不完全吻合，但3個(gè)品種樣品田間鑒定的不育系及恢復(fù)系與室內(nèi)ＳＳＲ的譜帶特征完全一致，即植株在田間表現(xiàn)為真實(shí)的母本特征，ＳＳＲ必然顯現(xiàn)出母本特征譜帶，同理植株在田間表現(xiàn)為真實(shí)的父本特征，ＳＳＲ譜帶必然顯現(xiàn)其父本的特征譜帶。

１）田間鑒定兩優(yōu)１７中株號(hào)為Ａ１１０２、Ａ２２０５、Ａ３５０１的3個(gè)雜株為典型的恢復(fù)系，在室內(nèi)同時(shí)被4對(duì)引物鑒定，具有恢復(fù)系的特征譜帶，并被包含在ＳＳＲ鑒定的１６個(gè)具有恢復(fù)系譜帶的雜株群體中，用“３∈１６”表示；代號(hào)為Ａ１７０８、Ａ１８０８、Ａ１８０９、Ａ１９０２、Ａ２２０２、Ａ２４０５、Ａ２５０３、Ａ３１０２、Ａ３１０８的９個(gè)雜株為典型的不育系，在室內(nèi)同時(shí)被4對(duì)引物鑒定，具有不育系的特征譜帶，并被包含在ＳＳＲ鑒定的６７個(gè)具有不育系譜帶的雜株群體中，用“９∈６７”表示。

２）田間鑒定苯兩優(yōu)６３９中編號(hào)為Ｂ０９１０、Ｂ２４０２的兩個(gè)雜株為典型的不育系，在室內(nèi)同時(shí)被3對(duì)引物鑒定，具有不育系的特征譜帶，并被包含在ＳＳＲ鑒定的７個(gè)具有不育系譜帶的雜株群體中，用“２∈７”表示。

３）田間鑒定天兩優(yōu)６１６中編號(hào)為Ｃ０１０６、Ｃ０４０８、Ｃ１００３的3個(gè)雜株為典型的不育系，在室內(nèi)同時(shí)被4對(duì)引物鑒定，具有不育系的特征譜帶，并被包含在ＳＳＲ鑒定的１５個(gè)具有不育系譜帶的雜株群體中，用“３∈１５”表示。

３結(jié)論與討論

水稻ＳＳＲ標(biāo)記具有豐富的多態(tài)性，利用已經(jīng)開發(fā)出的２ ７４０多對(duì)水稻ＳＳＲ引物［１３］，理論上可以篩選出適合任何一個(gè)兩系水稻雜交種純度鑒定的相應(yīng)的ＳＳＲ引物。試驗(yàn)分別篩選了能夠用于兩優(yōu)１７、苯兩優(yōu)６３９、天兩優(yōu)６１６雜交種純度鑒定的３~４對(duì)ＳＳＲ引物。

１）在沒有親本種子的情況下，無論用雜交種篩選出的引物，還是用親本種子篩選的引物來做純度鑒定，只要樣品來源于真實(shí)的品種，且混雜的雜株類型是該品種的恢復(fù)系和不育系，那么兩種方法篩選出的引物檢測(cè)出的純度結(jié)果應(yīng)該完全一致。從理論上看，這是由于兩系雜交水稻種子營養(yǎng)細(xì)胞中，每一條同源染色體上兩個(gè)單體ＤＮＡ分別來自其制種的恢復(fù)系和不育系。那么用同一引物，從恢復(fù)系、不育系純合的染色體ＤＮＡ上分別復(fù)制的兩個(gè)ＳＳＲ片段，和從其雜交種上復(fù)制的兩條ＳＳＲ片段，通過電泳得到的譜帶表現(xiàn)出的共顯性、多態(tài)性的特征應(yīng)該是一致的，否則，品種不真實(shí)，或者親本不真實(shí)。

２）試驗(yàn)中，若將用于篩選的引物數(shù)目增加，還可能找到更多的適宜某個(gè)品種檢測(cè)的引物。根據(jù)水稻基因測(cè)序，不同品種間ＤＮＡ分子結(jié)構(gòu)的差異較小，而且當(dāng)前兩系品種遺傳基礎(chǔ)同質(zhì)化嚴(yán)重，但這些篩選出的引物是否對(duì)該品種具有特異性或者對(duì)該品種特定樣品的雜株類型是否具有針對(duì)性，還有待研究。

３）試驗(yàn)中出現(xiàn)了同一引物適用于多個(gè)品種純度檢測(cè)的現(xiàn)象。當(dāng)樣品種子中混雜了可共用同一引物的品種時(shí)，例如早稻雜交種子兩優(yōu)１７與中稻雜交種天兩優(yōu)６１６，用共有引物ＲＭ１７檢測(cè)是否影響純度結(jié)果的可靠性，將在下一步試驗(yàn)中探討。

４）通過室內(nèi)與田間鑒定的比對(duì)，真實(shí)的本品種親本都能被鑒定，但也有部分雜株田間表現(xiàn)出親本特征，在ＳＳＲ檢測(cè)中卻不具有與親本對(duì)應(yīng)的特征譜帶。

參考文獻(xiàn)：

［１］薛燦輝，朱克永，陳祖武，等．利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定金優(yōu)２０７雜種純度技術(shù)研究［Ｊ］．湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００５（５）：６－８．

［２］李穩(wěn)香，詹慶才．雜交水稻種子純度ＳＳＲ指紋圖譜標(biāo)記鑒定技術(shù)研究［Ｊ］．中國種業(yè)，２００６（３）：２１－２２．

［３］李進(jìn)波，方宣鈞，楊國才，等．兩系雜交稻親本ＳＳＲ指紋圖譜的建立及其在種子純度鑒定中的應(yīng)用［Ｊ］．雜交水稻，２００５，２０（２）：５０－５３．

［４］張彥，郭士偉，何冰，等．利用ＳＳＲ標(biāo)記建立雜交水稻分子指紋圖譜數(shù)據(jù)庫［Ｊ］．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００６，２２（２）：１８１－１８３．

［５］戚華雄，楊蜀蘭，王斌，等．用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)鑒定雜交稻種子純度的初步研究［Ｊ］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，１９９９（１）：１２－１４．

［６］李進(jìn)波，楊國才，費(fèi)震江，等．兩優(yōu)９３２中不同串粉混雜株型的ＤＮＡ指紋分析［Ｊ］．分子植物育種，２００５，３（２）：２０９－２１２.

［７］ 楊劍波． 雜交水稻親本ＳＳＲ指紋圖譜［Ｍ］． 合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，２０１２．

［８］沙愛華，張端品．一種從干種子提?。模危劣糜冢遥粒校暮停樱樱曳治龅暮?jiǎn)便方法［Ｊ］． 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， ２００５， ２４（６）：５６１－５６３．

［９］劉衛(wèi)今，蔣向輝．缺乏親本材料條件下鑒定雜交水稻種子純度的研究［Ｊ］．種子，２００８，２７（６）：１５－１７．

［１０］蘇順宗，黃玉碧，楊俊品，等．利用ＳＳＲ鑒定水稻雜交種子純度的研究［Ｊ］．種子，２００３，２２（１）：２３－２５．

［１１］金偉棟，洪德林．雜交水稻品種純度鑒定研究進(jìn)展［Ｊ］．種子，２００５，２４（８）：４９－５４．

［１２］殷兆晴，王玉平，周黎軍，等．雜交稻種子純度的ＳＳＲ分子檢測(cè)及應(yīng)用研究［Ｊ］．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２００６，１９（６）：１０００－１００４．

［１３］ 何風(fēng)華．水稻基因組中的微衛(wèi)星標(biāo)記及其應(yīng)用［Ｊ］． 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，２００４，３０（５）：４８８－４９１．