摘要：利用原生質體進行生物技術育種的先決條件是其能再生完整植株，但目前一些基因型植物原生質體的培養(yǎng)仍然未獲得成功。綜述了植物原生質體頑拗現(xiàn)象，并從原生質體分離和培養(yǎng)過程中的氧化脅迫、原生質體再生能力差異的分子機制方面對與該現(xiàn)象有關的生理和遺傳基礎研究進展進行了綜述。

關鍵詞：原生質體；頑拗現(xiàn)象；氧化脅迫

中圖分類號：Ｑ９４３．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）10－1954-03

植物的細胞或組織具有分化成該物種的所有組織或器官的能力。然而，離體培養(yǎng)中普遍存在頑拗現(xiàn)象，即在離體條件下植物組織、器官或細胞喪失了脫分化或分化的能力，不能再生植株。植物原生質體是去除細胞壁后原生質膜所包圍的具有生活力的裸露細胞，是獲得單細胞無性系、選育突變體及體細胞雜交的優(yōu)良起始材料。自１９７１年Ｔａｋｅｂｅ和Ｎａｇａｔａ首次利用煙草葉片分離原生質體并獲得再生植株以來，隨著原生質體培養(yǎng)體系的不斷改進，由原生質體再生成株的植物種類越來越多，其中包括一些難度較大的糧食作物，如禾谷類和豆類［１，２］。然而，一些基因型植物原生質體培養(yǎng)過程中還存在較為普遍的頑拗現(xiàn)象。本文對近年來植物原生質體培養(yǎng)中的頑拗現(xiàn)象及其生理和遺傳基礎的研究進展進行了綜述，以期為頑拗現(xiàn)象的克服從遺傳機制上尋找突破口提供參考。

１原生質體頑拗現(xiàn)象

利用原生質體進行生物技術育種的先決條件是原生質體能再生完整植株。在原生質體培養(yǎng)過程中，高度分化的細胞要經(jīng)歷細胞壁再生、細胞分裂與生長、愈傷組織形成及植株再生等培養(yǎng)階段。其中每一階段能否順利進行都決定了原生質體培養(yǎng)的成功與否。１９７１年Ｔａｋｅｂｅ等首次利用煙草葉片分離原生質體并獲得了再生植株，證實了原生質體的全能性。此后，原生質體培養(yǎng)迅猛發(fā)展，研究對象的范圍不斷擴大，包括果樹、林木、藥用植物、蔬菜作物、大田作物、牧草等，其中部分植物的原生質體培養(yǎng)體系已經(jīng)建立［１－４］。然而，在大多數(shù)多年生木本和禾谷類等植物中，盡管進行了廣泛的研究，但是其原生質體培養(yǎng)仍然困難，只有少數(shù)獲得了成功，大多數(shù)植物表現(xiàn)出頑拗現(xiàn)象。

除了基因型外，原生質體培養(yǎng)還受外植體類型、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基種類、原生質體植板密度以及外源生長調(diào)節(jié)劑等多種因素的影響。例如，柑橘葉肉原生質體無論單獨培養(yǎng)還是共培養(yǎng)均不能再生，只有胚性愈傷組織來源的原生質體才能再生［５－７］。來源于甘藍型油菜子葉的原生質體進行固液雙層培養(yǎng)最終能夠獲得再生植株，葉肉原生質體分裂頻率低，發(fā)生褐化不能得到再生植株［８］。培養(yǎng)條件也會對原生質體培養(yǎng)產(chǎn)生重要影響，煙草ＮＣ８９葉肉細胞原生質體采用固液雙層培養(yǎng)在第一次分裂后能繼續(xù)分裂并形成大量細胞團，分裂頻率達到８５．３％，采用固體包埋培養(yǎng)只能進行２～３次分裂，分裂頻率只有５０．４％［９］。

２氧化脅迫與原生質體頑拗現(xiàn)象

植物原生質體在培養(yǎng)過程中會遭遇逆境反應等生理問題，例如細胞壁降解酶是一種逆境誘導劑，因此可以產(chǎn)生活化氧引起脂類過氧化。逆境反應大多數(shù)對原生質體制備和培養(yǎng)是不利的，甚至引起原生質體頑拗現(xiàn)象的發(fā)生。

２．１原生質體分離過程中的氧化脅迫

有研究表明，在燕麥葉片酶解分離原生質體的過程中，原生質體和細胞壁都會產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子又會發(fā)生歧化作用產(chǎn)生過氧化氫［１０］。甘藍型油菜葉片酶解反應液中積累的過氧化氫含量是正常葉片中的１．５倍，這些活性氧具有很高的反應活性，可對機體產(chǎn)生毒害，破壞生物大分子，影響細胞活性，最終造成原生質體培養(yǎng)過程中細胞的死亡［１１］。因此，在酶解過程中可以加入谷胱甘肽來進行保護。酶液的組成也會影響活性氧的產(chǎn)生，切碎或使用單一酶處理煙草葉片不會引發(fā)活性氧的產(chǎn)生，用混合酶液酶解煙草葉片產(chǎn)生了大量的超氧陰離子和過氧化氫，在煙草原生質體中檢測到了兩種活性氧合成酶，一種只能參與超氧陰離子的合成，另一種能夠參與所有活性氧合成，而在葡萄原生質體中只檢測到了能夠參與所有活性氧合成的合成酶［１２］。

２．２原生質體培養(yǎng)過程中的氧化脅迫

原生質體培養(yǎng)的頑拗現(xiàn)象與原生質體中氧化還原平衡狀態(tài)有關，原生質體分離的過程中產(chǎn)生活性氧，造成頑拗現(xiàn)象的原因是活性氧清除機制沒有啟動，抗氧化防御沒有被激活，原生質體內(nèi)是一個低氧化還原狀態(tài)，抑制了細胞周期的恢復，最終導致了細胞的死亡［１３］。谷類植物的葉肉原生質體極其不穩(wěn)定，在培養(yǎng)的２４ ｈ內(nèi)會發(fā)生細胞溶解。用硫代巴比妥酸和硫酸亞鐵檢測到玉米和小麥原生質體培養(yǎng)中有過氧化物及其降解產(chǎn)物的積累，且谷類植物葉肉原生質體質膜的過氧化反應會抑制原生質體的有絲分裂［１４］。大麥葉肉原生質體培養(yǎng)過程中，由于質膜的過氧化反應而產(chǎn)生丙二醛，谷胱甘肽的的含量會減少，這些都是遭受氧化脅迫的表現(xiàn)［１５］。煙草葉肉原生質體培養(yǎng)能夠獲得再生植株，與不能獲得再生植株的葡萄葉肉原生質體相比，可溶性蛋白質的含量較高，過氧化物酶的活性顯著增強，過氧化物同工酶的種類也較多［１６］。煙草原生質體培養(yǎng)能夠檢測到過氧化氫酶，而葡萄原生質體培養(yǎng)時檢測不到過氧化氫酶［１７］。

３原生質體再生能力差異的分子機制

細胞壁再生是原生質體培養(yǎng)的一個關鍵階段。植物細胞壁是一種動態(tài)的、有代謝活性的復雜聚合體結構，主要成分包含水、大分子多糖（纖維素、半纖維素及果膠等）、少量蛋白質和僅存在于特異細胞壁（如次生細胞壁）中的木質素。其基本功能不僅表現(xiàn)為決定和維持細胞形狀，而且也廣泛參與調(diào)控細胞生長和分化、抵御生物或非生物脅迫、細胞識別及信號轉導等過程［１８－２０］。細胞壁結構、組分的不同或變化影響植物許多發(fā)育過程。例如，果實在貯藏或軟化過程中，細胞壁結構、組分及細胞壁酶會發(fā)生改變［２１，２２］。總之，細胞壁合成是植物生長和分化的一個重要過程，細胞壁與植物生命活動的三個基本方面：生長發(fā)育與形態(tài)建成、物質與能量代謝以及逆境生理都密切相關。

植物原生質體細胞壁再生過程中，必然伴隨某些特殊基因的表達。最近，一些研究以植物原生質體為材料，探討原生質體細胞壁再生過程中相關基因的表達或相關蛋白質的合成。如Ｙａｎｇ等［２３］采用抑制性消減雜交技術，分析了棉花原生質體細胞壁再生過程中相關基因的差異表達，獲得了４１２個不同表達序列標簽（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ， ＥＳＴｓ），并成功測序了２１０條Ｕｎｉｇｅｎｅ。Ｗｉ■ｎｉｅｗｓｋａ等［２４］采用免疫細胞化學反應技術，發(fā)現(xiàn)在甜菜（不易再生）和煙草葉肉原生質體（易再生）細胞壁再生過程中，二者在蛋白質表達方面的差異?？傊?，深入研究原生質體再生細胞壁的組分、相關基因的表達和功能等，有可能揭示原生質體頑拗現(xiàn)象的分子機制。

４展望

如前所述，目前雖然利用原生質體技術進行作物遺傳改良并將其運用于生產(chǎn)實踐中還有一段距離，但植物原生質體的研究已取得了很大的進展。利用原生質體進行生物技術育種的先決條件是其能再生完整植株，但目前一些基因型植物原生質體的培養(yǎng)仍未獲得成功，原生質體培養(yǎng)中的頑拗現(xiàn)象較為普遍。對造成這一現(xiàn)象的生理基礎的研究比較深入，而其遺傳機制的研究才剛剛起步。深入研究頑拗現(xiàn)象的遺傳機制有助于人們克服這一難題，從而使植物原生質體培養(yǎng)技術能更好地服務于科研和生產(chǎn)。

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