周冬琴，莫海波，蘆治國，於朝廣，徐和寶，殷云龍

〔江蘇省·中國科學院植物研究所（南京中山植物園），江蘇 南京 210014〕

墨西哥落羽杉（Taxodium mucronatum Tenore）為杉科（Taxodiaceae）落羽杉屬（Taxodium Rich.）植物。20世紀70年代，同屬植物落羽杉〔T.distichum（L.） Rich.〕和池杉（T.ascendens Brongn.）大量應用于中國水網地區(qū)的綠化，隨即墨西哥落羽杉的應用也逐漸引起人們的重視。20世紀60年代葉培忠教授開展了墨西哥落羽杉（♀）與柳杉（♂）的雜交育種研究［1-2］；20世紀70年代開始，江蘇省·中國科學院植物研究所針對中國東部沿海灘涂面積廣和樹種資源缺乏的實際情況，開展了落羽杉屬樹種速生、耐濕、耐鹽堿品種的選育以及落羽杉（♀）與墨西哥落羽杉（♂）種間雜交等工作，并培育出‘中山杉302’和‘中山杉118’等新品種［3］，幾十年的品比試驗、中間示范試驗和江浙皖多點區(qū)域試驗均表明這些雜種無性系具有觀賞價值高、速生、耐濕、耐鹽堿、抗風力強、病蟲害少、材質優(yōu)良和適應性廣等特點［4-7］。為了進一步豐富墨西哥落羽杉種質資源，從2003年開始作者所在的研究小組先后從美國引進墨西哥落羽杉種源3批，并篩選出17個墨西哥落羽杉優(yōu)良單株。

雜交育種是通過不同個體間雜交創(chuàng)造變異和選育新品種的方法。雜交育種的物質基礎是種質差異，只有雜交親本間具有較多、較大的個體差異，才能創(chuàng)造出更多的變異。因此，育種材料遺傳多樣性的分析對于雜交育種親本選擇有著重要的理論指導意義。分子標記技術的發(fā)展為植物遺傳多樣性分析提供了可靠的技術手段，目前杉木遺傳育種研究工作中常用的分子標記有RAPD［8-10］、RFLP［11］和 ISSR［12-13］等，但都存在一些不足，如：RAPD標記的重復性和穩(wěn)定性較差，檢測位點不多；RFLP方法費時、費力，需要進行DNA多種酶切、轉膜以及探針的制備等多個步驟，且僅能夠對基因組單拷貝序列進行鑒定；ISSR分析方法在PCR擴增時需要一定時間摸索最適反應條件并且呈顯性遺傳標記，不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相關序列擴增多態(tài)性）標記是21世紀初誕生的新型DNA分子標記，由美國加州大學 Li和 Quiros開發(fā)［14］。該方法利用獨特的引物設計方法對編碼基因的開放閱讀框（ORF）區(qū)域進行設計，其多態(tài)性因個體間內含子有無、大小及啟動子與間隔長度不等而異，較AFLP和RAPD等標記更能反映表型的多樣性及進化史。Ferriol等［15］利用11對SRAP引物組合分析了47份南瓜〔Cucurbita moschata（Duch.ex Lam.） Duch.ex Poiret〕種質，多態(tài)性達66.2％；Budak等［16］利用SRAP分析了53種野牛草〔Buchloe dactyloides（Nutt.）Engelm.〕的遺傳多樣性，多態(tài)性高達95％。於朝廣等［17］利用48對SRAP引物對親本落羽杉與墨西哥落羽杉進行多態(tài)性分析，篩選出29對多態(tài)性引物，其中的1對引物可對落羽杉與墨西哥落羽杉的4個雜交后代進行雜種真實性鑒定。因而，利用SRAP標記可有效檢測種質資源的遺傳多樣性。

本研究旨在利用SRAP標記對墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的遺傳多樣性進行評價，為落羽杉屬雜交育種工作中優(yōu)良親本的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試18個單株均為墨西哥落羽杉的優(yōu)良單株。1～8號單株選自2003年引自美國加州的種源（原產墨西哥），于2004年分別種植于南京中山植物園實驗苗圃和浙江寧波永豐園林綠化建設有限公司苗圃，其中1～6號單株選自浙江群體，7～8號單株選自南京中山植物園群體；9～17號單株選自2005年由美國奧斯汀州立大學提供的種源（原產美國新墨西哥州），于2006年播種于南京中山植物園實驗苗圃；18號單株來源于南京中山植物園繁殖圃內的墨西哥落羽杉大樹，為南京本地產墨西哥落羽杉（來源于南京東南大學校園內）的扦插后代。

參照文獻［18］的方法確定優(yōu)良單株。通過簡單的目測比較確定10棵候選樹，以候選樹為中心，劃定面積15 m×15 m的樣方10個，隨機測量樣方十字線上30棵樹的株高、胸徑和冠幅并計算平均值和標準差，當候選樹的指標位于該基本群體相應指標平均值加0.5個標準差以上時則為優(yōu)良單株。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取及檢測 取新鮮嫩葉3～5 g置于液氮中快速研磨，采用CTAB法［19］提取總DNA并檢測其質量和濃度，然后溶解于TE緩沖液中，貯藏于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 SRAP引物篩選、擴增條件及擴增產物檢測參考Li等［14］發(fā)表的引物序列篩選SRAP引物，引物合成由上海英駿生物技術有限公司完成。選取15條正向引物和5條反向引物（表1）組合成45對引物，從中篩選出7對擴增條帶清晰、多態(tài)性豐富的引物組合對18個優(yōu)良單株總DNA進行PCR擴增。

表1 用于墨西哥落羽杉優(yōu)良單株總DNA SRAP標記分析的引物序列Table1 Primer sequences used for SRAP marker analysis of total DNA from superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore

采用Mastercycler ep PCR儀（德國Eppendorf公司）進行擴增反應。反應體系總體積10μL，包括20 ng模板DNA、1×PCR緩沖液、2.0 mmol·L-1Mg2+、0.2 mmol·L-1d NTPs、0.2 mmol·L-1引物和0.5 U Taq DNA聚合酶。反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸2 min，5個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃補齊5 min。擴增產物于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

擴增產物在DYY-8B型電泳儀（江蘇南達生物技術開發(fā)公司）上采用質量體積分數(shù)10％聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，電壓240 V，電泳時間2 h。電泳結束后參照文獻［20］采用快速銀染法顯色：先用含體積分數(shù)10％乙醇和體積分數(shù)0.5％冰乙酸的混合溶液固定12 min，用質量體積分數(shù)0.2％AgNO3溶液銀染12 min，水洗后用含質量體積分數(shù)1.5％ NaOH、體積分數(shù)0.4％甲醛和質量體積分數(shù)0.02％ Na2S2O3的混合溶液顯色5～10 min至譜帶清晰，自來水沖洗后在Tanon-2500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）中觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)相同遷移率條帶的有無進行統(tǒng)計，有條帶的記為“1”、無條帶的記為“0”，形成條帶的二元數(shù)據(jù)矩陣。在假定種群處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下，采用POPGENE v1.32軟件計算多態(tài)性條帶數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)和遺傳相似系數(shù)等；采用UPGMA分子系統(tǒng)聚類法由MEGA3.1軟件生成聚類圖。

2 結果和分析

2.1 SRAP擴增結果分析

選用18號優(yōu)良單株對所有引物組合進行初篩，有30對引物組合有清晰的擴增條帶；再用1號、3號、9號、12號和15號單株對初篩的30對引物組合進行復篩，篩選出19對具有清晰條帶的引物組合；然后采用這19對引物組合對18個優(yōu)良單株進行擴增，篩選出7對反應穩(wěn)定、重復性好的引物組合（表2）用于18個優(yōu)良單株的SRAP分析。

表2 用于墨西哥落羽杉優(yōu)良單株SRAP分析的引物組合及擴增結果Table2 Primer combinations used for SRAP analysis of superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore and amplification result

墨西哥落羽杉18個優(yōu)良單株的SRAP擴增結果見表2。由表2可見：7對引物組合共擴增出87條帶，多態(tài)性條帶71條，多態(tài)性條帶百分率為81.6％。其中用引物組合Me09+Em10擴增出的條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)均最多，分別達21和17條；用引物組合Me08+Em07、Me19+Em08和Me18+Em08擴增出的條帶數(shù)最少，均只有9條；用引物組合Me18+Em08擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)最少，僅6條。引物組合Me08+ Em07和Me19+Em08擴增出的多態(tài)性條帶百分率則達100.0％；引物組合Me18+Em08擴增出的多態(tài)性條帶百分率最低，僅66.7％。

2.2 墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的遺傳差異分析

根據(jù)引種地和種植地將18個墨西哥落羽杉優(yōu)良單株分為4組并采用SRAP標記進行遺傳多樣性分析，結果見表3。9～17號優(yōu)良單株的多態(tài)性條帶百分率（PPB）、觀察有效等位基因數(shù)（na）、有效等位基因數(shù)（ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon信息指數(shù)（I）最高，分別為64.4％、1.644、1.369、0.214和0.322；1～6號優(yōu)良單株的PPB、na、ne、H和I值居中，分別為52.9％、1.529、1.287、0.171和0.260；7號和8號2個優(yōu)良單株的PPB、na、ne、H和I值均最低，分別為25.3％、1.253、1.179、0.105和0.153；18號單株單獨成組，無法計算其PPB、na、ne、H和I值。18個優(yōu)良單株總體的PPB、na、ne、H和I值分別為81.6％、1.816、1.376、0.229和0.355。

表3 基于SRAP標記的18個墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的遺傳多樣性分析結果1）Table3 Analysis result of genetic diversity of eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore based on SRAP marker1）

對4組18個優(yōu)良單株的遺傳分化分析結果顯示：基因分化系數(shù)為0.4799，即有47.99％的遺傳變異存在于群體間；種水平的基因多樣性為0.235；組內的基因多樣性為0.122；基因流為0.542，表明各組間的基因交流比較少。

2.3 墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的聚類分析

墨西哥落羽杉18個優(yōu)良單株間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離見表4。18個優(yōu)良單株間的遺傳相似系數(shù)為0.6322～0.9195，平均值為0.7539。其中，3號和9號單株的遺傳相似度最大，遺傳相似系數(shù)為0.9195；5號和18號以及7號和10號單株間的遺傳相似系數(shù)均最小，為0.6322，而18號單株與另外17個單株的遺傳相似系數(shù)均較低，遺傳差異較大。

根據(jù)18個優(yōu)良單株的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA法進行聚類分析，結果見圖1。由圖1可見：在遺傳相似系數(shù)0.70處可以把18個單株分為3組：18號和14號單株分別單獨成組；其余的16個單株共同聚為1組。在遺傳相似系數(shù)0.80處又可把16個單株進一步分為8個亞組：1號、7號、12號和15號單株各自單獨成亞組，2號、3號、5號、9號、11號和13號單株聚為1個亞組，4號和6號單株、8號和17號單株、10號和16號單株各自聚為1個亞組。

表4 墨西哥落羽杉18個優(yōu)良單株間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離1）Table4 Genetic sim ilarity coefficient and genetic distance among eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore1）

續(xù)表4 Table4（Continued）

3 討論和結論

由于落羽杉屬樹種具有干型直、材質好、耐鹽堿和耐水濕等優(yōu)良特點，自引入中國以來一直倍受林學界的關注。為培育滿足國內生態(tài)環(huán)境建設需求的樹種，江蘇省·中國科學院植物研究所持續(xù)進行了落羽杉屬種間雜交的研究工作［21-23］，培育出‘中山杉302’、‘中山杉401’、‘中山杉405’、‘中山杉406’和‘中山杉407’等新品種［3，24］。隨著落羽杉屬雜交育種工作的進一步深入，需要不斷豐富雜交親本的遺傳多樣性，為此作者所在研究中心先后從美國引進墨西哥落羽杉種源3批。為了明確現(xiàn)有墨西哥落羽杉的遺傳多樣性狀況，作者通過基因組總DNA的SRAP標記對18個墨西哥落羽杉優(yōu)良單株進行了遺傳分析，結果顯示：18個墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.229，Shannon信息指數(shù)為0.355，遺傳相似系數(shù)為0.6322～0.9195，與周玉珍等［10］利用RAPD標記對53個墨西哥落羽杉優(yōu)良無性系進行的遺傳分析結果類似。說明引種可以有效豐富國內現(xiàn)有墨西哥落羽杉種質資源的遺傳多樣性。

在供試的18個優(yōu)良單株中，18號單株為目前國內樹齡最大的1株墨西哥落羽杉的無性系后代，存在生理年齡老化的問題。聚類分析結果表明：目前新篩選出的優(yōu)良單株（1～17號優(yōu)良單株）與18號優(yōu)良單株間的遺傳差異較大，這為選配新的雜交組合、培育優(yōu)良品種及創(chuàng)造優(yōu)良變異類型奠定了遺傳基礎。

根據(jù)聚類分析結果可將18個單株分為3組8亞組，每個亞組中的單株遺傳關系均較近，因此在選配雜交組合時可以選擇遺傳關系較遠的單株，以避免雜交親本單一等問題，從而在有限的土地資源和人力資源條件下創(chuàng)造更多的優(yōu)良雜交組合。

18個優(yōu)良單株的聚類分析結果與其引種地和種植地的相關性不明顯，這可能與本研究中優(yōu)良單株的選擇和引物的選擇有關。本實驗篩選出的引物組合數(shù)較少，對研究結果有一定的影響，因此，應進一步擴大引物篩選的范圍，對墨西哥落羽杉親本和雜交墨西哥落羽杉進行更為精確的遺傳分析。

圖1 18個墨西哥落羽杉優(yōu)良單株的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA cluster dendrogram of eighteen superior individuals of Taxodium mucronatum Tenore

［1］中國樹木志編委會.中國主要樹種造林技術：上冊［M］.北京：農業(yè)出版社，1978.

［2］陳永輝，王名金，伍壽彭.落羽杉屬的引種和選育［J］.江蘇林業(yè)科技，1988，15（2）：43-47.

［3］陳永輝，伍壽彭，王名金，等.中山杉302和401無性系在堿地上的生長和適應性的初步研究［J］.江蘇林業(yè)科技，1989，16（3）：14-18.

［4］陳永輝，伍壽彭，殷云龍，等.江蘇濱海鹽堿地中山杉造林推廣試驗［J］.江蘇林業(yè)科技，1996，23（4）：18-22.

［5］殷云龍，陳永輝.中山杉與池杉、落羽杉和水杉對比造林的調查和評價［J］.植物資源與環(huán)境，1997，6（3）：23-28.

［6］虞華強，費本華，趙榮軍，等.中山杉和落羽杉木材解剖性質研究［J］.林業(yè)科學研究，2007，20（2）：213-217.

［7］於朝廣，殷云龍.落羽杉屬樹木種間雜交育種研究進展［J］.江蘇林業(yè)科技，2008，35（2）：39-46.

［8］陳云鵬，潘士華，張建軍，等.利用RAPD檢測技術推測雜交落羽杉群落間的親緣關系［J］.復旦學報：自然科學版，2002，41（6）：641-646.

［9］李 涵，殷云龍，徐朗萊，等.落羽杉屬樹種及其雜交后代親緣關系的RAPD分析［J］.林業(yè)科學，2007，43（2）：48-51.

［10］周玉珍，李火根，張燕梅，等.墨西哥落羽杉無性系RAPD指紋圖譜的構建［J］.南京林業(yè)大學學報：自然科學版，2006，30（5）：29-33.

［11］LING Y，LUWF，LU F，et al.PCR-RFLP and AP-PCR of rbc L and ITS of rDNA show that×Taxodiomeria peizhongii（Taxodium× Cryptomeria）is not an intergeneric hybrid［J］.Journal of Integrative Plant Biology，2006，48（4）：468-472.

［12］哀建國，邱英雄，余久華，等.百山祖冷杉的ISSR分析優(yōu)化和遺傳多樣性初步研究［J］.浙江大學學報：農業(yè)與生命科學版，2005，31（3）：277-282.

［13］張 蕊，周志春，金國慶，等.南方紅豆杉種源遺傳多樣性和遺傳分化［J］.林業(yè)科學，2009，45（1）：50-56.

［14］LI G，QUIROS C F.Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.

［15］FERRIOLM，PICóB，NUEZ F.Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107（2）：271-282.

［16］BUDAK H，SHEARMAN R C，GAUSSOIN R E，et al.Application of sequence-related amplified polymorphism markers for characterization of turfgrass species［J］.HortScience，2004，39：955-958.

［17］於朝廣，殷云龍，徐建華.用SRAP標記鑒定落羽杉屬植物雜種［J］.林業(yè)科學，2009，45（2）：142-146.

［18］國家林業(yè)局編委會.全國森林培育技術標準匯編：種子苗木卷［S］.北京：中國標準出版社，2003：347-350.

［19］PATERSON A H，BRUBAKER C L，WENDEL J F.A rapid method for extraction of cotton（Gossypium spp.）genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis［J］.Plant Molecular Biology Reporter，1993，11（2）：122-127.

［20］袁菊紅，權俊萍，胡綿好，等.石蒜SRAP-PCR擴增體系的建立與優(yōu)化［J］.植物資源與環(huán)境學報，2007，16（4）：1-6.

［21］CREECH D，YIN Y L.TaxodiumבNanjing Beauty’：a new landscape plant for the south［J］.HortScience，2003，38：1292-1293.

［22］殷云龍，尹曉明，於朝廣，等.中山杉302回交一代的早期選育［J］.植物資源與環(huán)境學報，2003，12（2）：22-27.

［23］尹曉明，殷云龍，陳永輝.中山杉302和墨西哥落羽杉及其回交一代的同工酶分析［J］.植物資源與環(huán)境學報，2002，11（3）：59-61.

［24］於朝廣，殷云龍，徐建華.落羽杉屬4個新品種［J］.林業(yè)科學，2011，47（5）：181-182.