胡能兵，何克勤

（安徽科技學院植物科學學院，安徽 鳳陽 233100）

箭葉秋葵〔Abelmoschus sagittifolius（Kurz.）Merr.〕又名紅花馬寧、銅皮、五指山參、小紅芙蓉、巖酸，系錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（Abelmoschus Medic.）多年生亞灌木狀草本；其根既可食用又可入藥，具有滋養(yǎng)強壯之功效，可用于治療神經(jīng)衰弱、頭暈、腰腿痛、胃痛及腹瀉等［1］。

目前，利用愈傷組織懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)藥用植物次生代謝物的研究較多，如：通過人參（Panax ginseng C.A.Mey.）、西洋參（P.quinquefolium L.）、銀杏（Ginkgo biloba L.）、環(huán)草石斛（Dendrobium loddigesii Rolfe）、喜樹（Camptotheca acuminata Decne.）、高山紅景天（Rhodiola sachalinensis Boriss.）和虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）等的愈傷組織分別提取皂苷、黃酮、總生物堿、喜樹堿、紅景天甙、白藜蘆醇等活性成分［2－8］。然而，目前國內(nèi)關于秋葵屬植物愈傷組織培養(yǎng)的研究較少，僅見黃秋葵即黃蜀葵〔Abelmoschusmanihot（L.）Medic.〕再生體系的研究報道［9－10］。

作者對箭葉秋葵子葉和下胚軸愈傷組織誘導及增殖培養(yǎng)過程中的激素組合進行了篩選，以其為該種愈傷組織快速培養(yǎng)體系的建立奠定前期實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

箭葉秋葵種子于2008年10月采自安徽省蕪湖市南陵縣綠嶺鎮(zhèn)農(nóng)田，置于干燥器中保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 種子前處理及萌發(fā) 于2009年6月進行種子萌發(fā)。種子用自來水沖洗干凈后，用洗衣粉水刷洗片刻，再用自來水沖洗8～10 min，在超凈工作臺上用體積分數(shù)75％乙醇消毒1 min，再用質(zhì)量濃度1 g·L－1HgCl2溶液消毒13 min，無菌水洗4～5次；將種子接種到僅含質(zhì)量濃度5.5 g·L－1瓊脂的培養(yǎng)基中，置于（25±2）℃的黑暗條件下進行種子萌發(fā)培養(yǎng)，待子葉露出后接種。

1.2.2 愈傷組織誘導培養(yǎng)基中激素組合的篩選 設6個激素組合：0.5 mg·L－12，4－D和0.0 mg·L－1KT、1.0 mg·L－12，4－D和0.0 mg·L－1KT、2.0 mg·L－12，4－D和0.0 mg·L－1KT、0.5 mg·L－12，4－D和0.1 mg·L－1KT、1.0 mg·L－12，4－D和0.1 mg·L－1KT及2.0 mg·L－12，4－D和0.1 mg·L－1KT。將子葉沿主脈剪開、下胚軸剪成2段，分別接種到含有不同激素組合的愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，添加5.5 g·L－1瓊脂和30 g·L－1蔗糖，pH6.0）上。子葉片和下胚軸段分瓶接種，子葉片正接（上表皮朝上）、下胚軸橫接（水平放置），每瓶接種4個子葉片或2個下胚軸段，每處理各接種6瓶，各處理均接種24個子葉片和12個下胚軸段。在溫度（25±2）℃、光照度2000 lx、光照時間12 h·d－1的條件下培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率并描述其生長狀況。

1.2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng)基中激素組合的篩選 共設置8個激素組合：1 mg·L－16－BA和0.5 mg·L－1NAA、2 mg·L－16－BA和0.5 mg·L－1NAA、1 mg·L－1KT和0.5 mg·L－1NAA、2 mg·L－1KT和0.5 mg·L－1NAA、1 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1NAA、2 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1NAA、1 mg·L－1KT和1.0 mg·L－1NAA及2mg·L－1KT和1.0 mg·L－1NAA。采用篩選出的最佳愈傷組織誘導培養(yǎng)基并以子葉為外植體誘導出大量愈傷組織，將愈傷組織分成8份，分別接種到含有不同激素組合的愈傷組織增殖培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，添加5.5 g·L－1瓊脂和30 g·L－1蔗糖，pH6.0）上。每瓶接種4塊愈傷組織，每處理6瓶。在溫度（25±2）℃、光照度2000 lx、光照時間12 h·d－1的條件下培養(yǎng)，15 d后統(tǒng)計愈傷組織生長量。

1.3 愈傷組織平均生長量的計算

為了準確計算增殖過程中愈傷組織的平均生長量，在增殖培養(yǎng)瓶中先放入大小適合的無菌濾紙1片，稱量，記為Ga；接種愈傷組織后，稱量，記為Gb；Gb與Ga的差值為接種質(zhì)量（Gc）。培養(yǎng)結(jié)束后，將濾紙上的愈傷組織取出稱量，記為Gd；Gd與Gc的差值即為愈傷組織的生長量。根據(jù)每處理各瓶愈傷組織的生長量總和及瓶數(shù)計算愈傷組織的平均生長量。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同激素組合對箭葉秋葵愈傷組織誘導的影響

分別用箭葉秋葵的子葉和下胚軸為外植體進行愈傷組織誘導，誘導培養(yǎng)基中不同激素組合對愈傷組織誘導率和生長的影響見表1。由表1可見：接種25 d后，在6種含不同激素組合的誘導培養(yǎng)基中箭葉秋葵子葉和下胚軸的愈傷組織誘導率幾乎都超過90％，且誘導率隨2，4－D質(zhì)量濃度的提高而增加，但在不同培養(yǎng)基上愈傷組織的顏色及生長狀況差別較大。誘導自子葉的愈傷組織多呈淡黃色，且黑色物質(zhì)較少，生長狀況明顯優(yōu)于誘導自下胚軸的愈傷組織；后者多顯乳白色，且黑色物質(zhì)較多，不適宜用于下一步的研究。綜合比較結(jié)果表明：含有1.0 mg·L－12，4－D和0.1 mg·L－1KT的誘導培養(yǎng)基適宜于箭葉秋葵子葉愈傷組織的誘導，誘導率可達100.0％，且愈傷組織生長狀況良好。

表1 不同激素組合對箭葉秋葵子葉和下胚軸愈傷組織誘導的影響Table1 Effect of different hormone combinations on callus induction from cotyledon and hypocotyl of Abelmoschus sagittifolius（Kurz.）Merr.

2.2 不同激素組合對箭葉秋葵愈傷組織增殖的影響

在含不同激素組合的增殖培養(yǎng)基上箭葉秋葵愈傷組織的平均生長量見表2。由表2可以看出：在增殖培養(yǎng)基中添加不同種類及質(zhì)量濃度的激素組合，箭葉秋葵愈傷組織的平均生長量有明顯差異；在含6－BA與NAA的培養(yǎng)基中愈傷組織的每瓶平均生長量都超過7 g，而在含KT與NAA的培養(yǎng)基中愈傷組織的每瓶平均生長量都低于5.5 g。培養(yǎng)15 d后，在含有2 mg·L－16－BA和1 mg·L－1NAA的增殖培養(yǎng)基中愈傷組織的每瓶平均生長量最大，達到9.74 g。

3 結(jié) 論

在組織培養(yǎng)過程中，大多數(shù)植物的愈傷組織誘導過程都需要添加外源激素2，4－D，添加的質(zhì)量濃度范圍為0.001～10 mg·L－1，但由于遺傳背景及代謝途徑不同，有些植物〔如薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）〕的愈傷組織誘導過程中并不需要添加2，4－D［11］。本研究結(jié)果表明：在僅添加2，4－D的培養(yǎng)基中，箭葉秋葵愈傷組織的誘導率及生長狀況較差，而其愈傷組織誘導的最佳激素組合是1.0 mg·L－12，4－D和0.1 mg·L－1KT，與多數(shù)植物愈傷組織誘導條件相似。另外，不同外植體的誘導效果也有明顯差異，以子葉為外植體進行愈傷組織誘導，效果較好。

表2 不同激素組合對箭葉秋葵愈傷組織增殖的影響Table2 Effect of different hormone combinations on callus proliferation of Abelmoschus sagittifolius（Kurz.）Merr.

研究結(jié)果表明：箭葉秋葵愈傷組織在含6－BA和NAA的增殖培養(yǎng)基中的平均生長量明顯高于含KT和NAA的培養(yǎng)基。在添加2 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1NAA的增殖培養(yǎng)基中每瓶愈傷組織的平均生長量最大，故可將其作為箭葉秋葵子葉愈傷組織增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。

［1］胡能兵，張子學，隋益虎，等.外源生長素對箭葉秋葵種子萌發(fā)及幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響［J］.激光生物學報，2009，18（3）：315－319.

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［4］張 磊，楊世海.外源NO對人參愈傷組織次生代謝產(chǎn)物的影響［J］.人參研究，2010，22（1）：5－9.

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［11］于 盱，李維林，梁呈元，等.兩個薄荷品種葉片愈傷組織的誘導及增殖［J］.植物資源與環(huán)境學報，2009，18（2）：84－88.