喬志華

（臨汾市食品藥品檢驗(yàn)所，山西 臨汾041000）

妥布霉素是具有廣譜抗菌活性的氨基糖苷類(lèi)抗生素，具有療效高和毒性低的特點(diǎn)。氨基糖甙類(lèi)抗生素沒(méi)有紫外吸收，無(wú)法采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。其含量測(cè)定一般采用［1－3］生物效價(jià)測(cè)定法、旋光法、衍生化紫外分光光度法、高效液相色譜衍生化法、薄層色譜法等，近年來(lái)已有關(guān)于蒸發(fā)光散射檢測(cè)技術(shù)分析氨基糖苷類(lèi)抗生素的報(bào)道出現(xiàn)，而2005年版的中國(guó)藥典也已收載了蒸發(fā)光散射檢測(cè)技術(shù)和相關(guān)品種。本文建立高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)妥布霉素的含量，報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

LC－2010 型 高 效 液 相 色 譜 儀（日 本 島 津 公 司）；SEDEX75 型 蒸 發(fā) 光 散 射 檢 測(cè) 器；VP ODS C18色 譜 柱（4.6mm×250mm，5μm）；三氯醋酸為分析純，甲醇為色譜純，水為蒸餾水。妥布霉素對(duì)照品含量91.4%，批號(hào)：130527－200403），新霉胺對(duì)照品，批號(hào)85－1108；卡那霉素B對(duì)照品，批號(hào)130548－20052，均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：VP ODS C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.2mol／L 的三氯醋酸－甲醇（90∶10）；流速：1.0mL／min；蒸發(fā)光散射器的漂移管溫度：40℃，霧化氣體壓力為3.5bar（高純氮?dú)猓?/p>

2.2 專(zhuān)屬性考察

精密稱(chēng)取妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品、卡那霉素對(duì)照品和新霉胺標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于100mL 容量瓶中，加水至刻度，制成濃度為1mg／mL的溶液，量取5mL 與硫酸溶液（濃度為2×10－3mL／mL）5mL混合作為混合溶液，精密量混合溶液20μL進(jìn)樣，記錄色譜（圖略）。結(jié)果顯示，硫酸根（2.463min）、卡那霉素（4.395min）、新霉胺（4.286min）的色譜峰與妥布霉素（5.257min）峰的分離度分別為14.33、5.96、1.31，卡那霉素和新霉胺這兩種雜質(zhì)不干擾妥布霉素的測(cè)定。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系考察

對(duì)照品配制：精密稱(chēng)取妥布霉素對(duì)照品，置于100mL容量瓶加水稀釋?zhuān)瑩u勻，制成199.45μg的溶液，分別進(jìn)樣20、25、35、45、50、60μL，記錄峰面積。以進(jìn)樣量所相當(dāng)濃度的對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)（IgA）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程：lgA＝1.1216lgC＋6.537 2（r＝0.999 8，n＝6）。結(jié)果，妥布霉素檢測(cè)濃度的線(xiàn)性范圍為241.3～1 867.9μg／mL。

2.4 重復(fù)性檢查

供試品溶液配制：分別精密稱(chēng)取妥布霉素和硫酸妥布霉索適量，加水分別制成1mL／mg的溶液，搖勻，即得，平行制備6份。按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算含量，結(jié)果妥布霉素的平均含量為73.72%，RSD為0.73%；硫酸妥布霉素中妥布霉素的平均含量為62.41%，RSD 為0.79%，表明本法重復(fù)性良好。

2.5 回收率考察

精密稱(chēng)取已知含量的硫酸妥布霉素樣品適量（分別為濃度高、中、低各3份）和與之相對(duì)應(yīng)量的妥布霉素對(duì)照品9份，分別置于50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取10μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算回收率，測(cè)得回收率分別為99.9%，99.7%，99.5%。平均回收率為99.7%，RSD＝0.43%，結(jié)果顯示回收率良好。

2.6 樣品含量測(cè)定

取妥布霉素對(duì)照品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量所相當(dāng)濃度的對(duì)數(shù)（lgC）為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)（IgA）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程：lgA＝algC＋b；取供試品溶液，分別平行進(jìn)樣，測(cè)定供試品溶液主峰的平均峰面積（A），并根據(jù)對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算供試品溶液中妥布霉素的濃度［10＾（19A－b）／a］，然后再根據(jù)供試品溶液的稱(chēng)樣量，計(jì)算供試品中妥布霉素的含量。結(jié)果如表1所示，采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法與生物檢定法含量測(cè)定結(jié)果相似。

表1 高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法與生物檢定法含量測(cè)定結(jié)果 （%）

3 討論

色譜條件的選擇：氨基糖苷類(lèi)藥物為離子化合物，極性很強(qiáng)，故采用非衍生化的HPLC法時(shí)，通常用反相離子對(duì)色譜法進(jìn)行測(cè)量。一般的離子對(duì)試劑揮發(fā)性較差，而全氟化羧酸如三氯醋酸對(duì)試劑的揮發(fā)性較好，分離效果理想，故本實(shí)驗(yàn)選擇三氯醋酸為流動(dòng)相［4］。選擇溶劑時(shí)，考慮到妥布霉素及硫酸妥布霉素均易溶于水，且水又同時(shí)為流動(dòng)相的主要組成部分，與流動(dòng)相分別制備溶液測(cè)定時(shí)，色譜峰的各項(xiàng)參數(shù)接近，差異不大，故可選擇水為溶劑。流動(dòng)相的流速對(duì)各成分之間的分離度產(chǎn)生的影響不大，但如果流速過(guò)低會(huì)導(dǎo)致出峰緩慢、峰形擴(kuò)散，流速過(guò)高又會(huì)使柱壓升高。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出，選擇1.0mL／min的流速時(shí)可得到較為理想的色譜行為。柱溫升高可減少保留時(shí)間和增加柱效，但對(duì)色譜柱本身會(huì)產(chǎn)生一定的影響，減少柱子壽命，40℃為較適合的溫度。檢測(cè)器參數(shù)的選擇：通過(guò)考察不同溫度的檢測(cè)結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)器漂移管溫度設(shè)置為40℃時(shí)，峰響應(yīng)最大，基線(xiàn)也較平穩(wěn)、噪音較小。而設(shè)置不同的載氣壓考察時(shí)，當(dāng)載氣壓為3.5bar時(shí)，基線(xiàn)與色譜響應(yīng)處于較合適的位置，故采用之。含量測(cè)定方法的選擇：根據(jù)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的原理，樣品濃度和檢測(cè)器響應(yīng)之間呈指數(shù)關(guān)系，轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)可呈線(xiàn)性關(guān)系，方便計(jì)算。采用微生物檢測(cè)法測(cè)定含量的結(jié)果與本文所用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)結(jié)果相近，但本文方法簡(jiǎn)單，快速，更符合實(shí)驗(yàn)操作的要求。

本文建立的高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)妥布霉素的方法與其他方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)［5］：不需要進(jìn)行衍生化，排除了具有與妥布霉素相近理化性質(zhì)的其他氨基糖苷類(lèi)化合物的干擾，減少樣品前處理可能產(chǎn)生的誤差，提高了分析準(zhǔn)確度。

［1］ 蘇藻.妥布霉素測(cè)定方法研究進(jìn)展［J］.海峽藥學(xué)，2004，16（4）：13.

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［3］ 洪利婭，陳悅，陳貴斌，等.HPLC－ELSD法測(cè)定妥布霉素的含量［J］.中國(guó)抗生素雜志，2005，30（11）：662.

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［5］ 顏彥，王康俊.HPLC－ELSD 法測(cè)定硫酸妥布霉素注射液含量［J］.中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2007，7（9）：1674－1675.