丁 勇，范紅波，張高磊，嚴(yán)宇庭，李瑞陽

麻瘋樹種子總RNA提取方法研究

丁 勇，范紅波，張高磊，嚴(yán)宇庭，李瑞陽

（西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

采用RNAiso Plus法、RNApure Plant Kit法和改良CTAB法分別提取麻瘋樹種子總RNA，以期篩選適合于麻瘋樹種子高質(zhì)量總RNA提取方法。用瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和得率。結(jié)果表明：RNAiso Plus法提取麻瘋樹種子總RNA的A260/A280比值為2.030，28S和18S rRNA條帶清晰，且前者的亮度約為后者的2倍，無可見的彌散現(xiàn)象，利用該方法提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR，成功克隆獲得了麻瘋樹oleosin基因長603 bp的cDNA序列。證明RNAiso Plus法提取麻瘋樹種子總RNA可滿足后續(xù)RT-PCR、RACE-PCR和基因全長克隆等分子生物學(xué)研究。

麻瘋樹；種子；RNA提?。环崔D(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

麻瘋樹(Jatropha curcas L.)又名小桐子、膏桐等，是大戟科(Euphorbiaceae)麻瘋樹屬(Jatropha)多年生亞喬木[1]。麻瘋樹種子富含大量的油脂，可作為理想的生物柴油，并作為柴油機(jī)燃料的替代品開始凸顯其重要性[1-3]。含油植物種子中積累的油脂主要是以三酰甘油(Triglycerides，TAGs)的形式儲(chǔ)藏在油體(Oil Bodies，OBs)中[4-5]。研究表明油體膜蛋白(Oil-body-membrane Proteins)對(duì)于植物油體的形成與穩(wěn)定起著重要作用[6-8]。因此，為了深入開發(fā)利用麻瘋樹種子的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究麻瘋樹種子油體膜蛋白及其基因已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急，而從麻瘋樹種子中分離高質(zhì)量的總RNA卻是關(guān)鍵。麻瘋樹種子在發(fā)育成熟過程中合成并積累大量的油脂、毒性化合物和次生代謝產(chǎn)物，尤其是在發(fā)育4～5周的種子中顯著富集[9]，這些化合物會(huì)直接影響植物組織RNA的有效提取[10-11]。雖然已有少量關(guān)于麻瘋樹種子總RNA提取的報(bào)道[12-14]，但仍比較薄弱。本試驗(yàn)比較研究了RNAiso Plus法、RNApure Plant Kit法和改良CTAB法等3種方法提取麻瘋樹種子總RNA，以期篩選從麻瘋樹種子中提取高質(zhì)量總RNA的最佳方法，為開展麻瘋樹種子后續(xù)mRNA分離和油體膜蛋白基因克隆等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

試驗(yàn)材料是種植于中國科學(xué)院西雙版納植物園的3年生麻瘋樹植株。待麻瘋樹開花后4～5周，取其未成熟種子，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。RNA提取時(shí)，去除種殼，種仁置于液氮中研磨。

研缽、研杵和玻璃制品均在180 ℃烘烤8 h以上，進(jìn)行無RNA酶處理；用0.1% DEPC水配制試劑和浸泡離心管、槍頭等聚乙烯塑料制品，室溫處理至少24 h后在121 ℃下高溫高壓滅菌30 min。

RNAiso Plus試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；RNApure Plant Kit購自康為世紀(jì)(北京)生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 RNA提取方法

RNAiso Plus法根據(jù)TaKaRa試劑盒說明書操作。RNApure Plant Kit法根據(jù)康為世紀(jì)生物科技有限公司試劑盒說明書操作。改良CTAB法根據(jù)丁勇等[15]報(bào)道的方法改良而成，操作步驟如下：

①取0.15 g麻瘋樹種仁，加液氮研磨至粉狀，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中。加入65 ℃預(yù)熱的提取緩沖 液 [0.1 mol/L Tris-HCl(pH值 8.0)，0.05 mol/L EDTA(pH 值 8.0)，2% CTAB(W/V)，2% PVP(W/V)，2 mol/L NaCl，2% β-ME(V/V)] 600 μL，蓋緊管口，渦旋混勻，然后65 ℃溫育30 min，期間每隔5 min搖勻1次。

②加入等體積的氯仿：異戊醇(24∶1)，渦旋混勻，于4 ℃，12 000 r/min離心10 min，取上清液至另一個(gè)新的2 mL離心管中。重復(fù)抽提1～2次。

③取上清液至另一個(gè)新的2 mL離心管中，加入1/10倍提取液體積的10 mol/L LiCl，混勻，-20 ℃放置3 h后，于4 ℃，12 000 r/min離心10 min。

④棄上清，沉淀溶于75 μL DEPC水中，加入60 μL 3 mol/L NaAc(pH值5.2)和2.5倍提取液體積的預(yù)冷的無水乙醇，混勻，-80℃放置30 min后，于4℃，12 000 r/min離心20 min。

⑤棄上清，RNA沉淀用1 mL預(yù)冷的70%乙醇清洗1～2次。

⑥總RNA沉淀于超凈工作臺(tái)中干燥，變透明即可。

⑦總RNA溶于50 μL DEPC處理的無RNase水中，放置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA純度及完整性檢測(cè)

5 μL總RNA在1.2%瓊脂糖甲醛變性凝膠中電泳，紫外成像系統(tǒng)下觀察，檢驗(yàn)總RNA完整性。2 μL總RNA用DEPC處理的無菌水稀釋200倍，加入到比色皿中，采用Biochrom Libra S22-紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的含量及純度。

1.4 RT-PCR

試驗(yàn)設(shè)計(jì)麻瘋樹油質(zhì)蛋白o(hù)leosin基因的同源性簡(jiǎn)并引物對(duì)，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)分別將三種方法提取的麻瘋樹種子總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP(each 10 mmol/L)0.4 μL，上下游引物 (10 μmol/L) 各 1 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 2 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.6 μL，Taq 酶0.2 μL，加dd H2O至總體積20 μL。PCR循環(huán)條件：94℃ 3 min；9 4℃ 30 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻瘋樹種子總RNA純度分析

本研究試驗(yàn)了RNAiso Plus法、RNApure Plant Kit法和改良CTAB法提取麻瘋樹種子總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，總RNA的A260/A280比值、濃度和得率，以及試驗(yàn)所需時(shí)間等結(jié)果如表1顯示。RNAiso Plus法和RNApure Plant Kit法提取總RNA的A260/A280比值分別為2.030和1.881，表明RNA純度較好，無蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)等雜質(zhì)污染。改良CTAB法提取總RNA的A260/A280比值為1.723，表明RNA的純度較差，不能有效去除總RNA樣品中蛋白質(zhì)、多糖和酚類物質(zhì)等雜質(zhì)。從總RNA得率來看，RNAiso Plus法最高，為 2.460 μg/g(RNA/樣品 )；RNApure Plant Kit法次之，為 1.807 μg/g(RNA/樣品)；改良CTAB法最低，僅為0.359 μg/g(RNA/樣品)。從試驗(yàn)所耗時(shí)間來看，RNApure Plant Kit法所需時(shí)間最短，僅需2.5 h；改良CTAB法所需時(shí)間最長，耗時(shí)12 h；RNAiso Plus法適中，需4 h。綜合試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明RNAiso Plus法和RNApure Plant Kit法抽提獲得的麻瘋樹種子總RNA純度較好，改良CTAB法沒有從麻瘋樹種子中提取獲得純度好的總RNA。

表1 3種方法提取麻瘋樹種子總RNA純度分析Table 1 Purity comparison of total RNA extraction with three methods from seeds of Jatropha curcas L.

2.2 麻瘋樹種子總RNA完整性分析

三種方法提取的麻瘋樹種子總RNA完整性由圖1的電泳結(jié)果顯示。RNAiso Plus法獲得的總RNA完整性好，28S和18S rRNA條帶清晰可見(如圖1-A)，且前者的亮度約為后者的2倍，無彌散現(xiàn)象，點(diǎn)樣孔中無亮斑現(xiàn)象，表明RNA完整，既無DNA存在，又無蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)污染。RNApure Plant Kit法提取的總RNA雖可見28S和18S rRNA條帶(如圖1-B)，但28S rRNA條帶亮度沒有18S rRNA條帶的強(qiáng)，有可見的彌散現(xiàn)象，推測(cè)RNA存在一定的降解現(xiàn)象。應(yīng)用改良CTAB法提取獲得的總RNA完整性較差，28S和18S rRNA條帶模糊(如圖1-C)，具明顯的彌散現(xiàn)象，表明總RNA存在較嚴(yán)重的降解現(xiàn)象。表明RNAiso Plus法提取的麻瘋樹種子總RNA完整性較好，RNApure Plant Kit法和改良CTAB法抽提的麻瘋樹種子總RNA完整性較差。

2.3 RT-PCR檢測(cè)

圖1 3種方法提取麻瘋樹種子總RNA的甲醛變性凝膠電泳Fig.1 Denaturalization formaldehyde agarose gelelectrophoretogram of total RNA extraction with three methods from seeds of Jatropha curcas L.

RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，利用RNAiso Plus法獲得的麻瘋樹種子總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR能夠成功獲得1條特異性cDNA片段(如圖2)，克隆測(cè)序確定為麻瘋樹oleosin基因的部分cDNA序列，長603 bp。而利用改良CTAB法和RNApure Plant Kit法獲得的麻瘋樹種子總RNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，沒有獲得理想結(jié)果。表明RNAiso Plus法所提取的麻瘋樹種子總RNA能滿足后續(xù)的RT-PCR和全長基因克隆等分子操作的要求。

圖2 以RNAiso Plus法提取的麻瘋樹種子總RNA為模板進(jìn)行oleosin基因cDNA片段擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification of partial cDNA of Oleosin gene with RNA as templates isolated by RNAiso Plus method from seeds of Jatropha curcas L.

3 討 論

含油植物種子在發(fā)育期間表達(dá)的油體膜蛋白主要有oleosin、Sop1、Sop2和Sop3[16]。油體膜蛋白基因在早期發(fā)育的種子中表達(dá)量低，當(dāng)種子達(dá)到最大鮮重并開始脫水時(shí)基因高水平表達(dá)[17]。為了后續(xù)研究麻瘋樹種子油體膜蛋白及其基因需要，研究選擇了麻瘋樹開花后4～5周的未成熟種子來進(jìn)行RNA提取試驗(yàn)。

RNA是一種極易降解的核酸分子，獲得純度高、完整性好的RNA是后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)成功的關(guān)鍵。在麻瘋樹種子發(fā)育成熟過程中，油體膜蛋白基因豐度表達(dá)[17]，同時(shí)顯著富集大量的油脂、毒性化合物和次生代謝產(chǎn)物[9]，這些特殊成分干擾了總RNA的抽提。已報(bào)道的麻瘋樹種子總RNA提取方法[12-14]仍比較薄弱。本研究應(yīng)用的改良CTAB法操作復(fù)雜，耗時(shí)較長，提取的總RNA純度和完整性最差，得率最低；RNApure Plant Kit法雖操作最簡(jiǎn)單快捷，但提取的總RNA完整性也較差，得率也較低；這兩種方法提取的總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行RT-PCR，均不能獲得目的基因片段，證明此兩種方法不適合用以提取麻瘋樹種子總RNA。

RNAiso Plus法適宜從麻瘋樹種子中提取獲得純度和完整性較好的總RNA。RNAiso Plus主要成分為異硫氰酸胍和8-羥基喹啉。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍使細(xì)胞結(jié)構(gòu)迅速被破壞，使RNA從細(xì)胞中釋放出來，同時(shí)高濃度異硫氰酸胍還使細(xì)胞內(nèi)的RNA酶失活，使釋放出的RNA不被降解。8-羥基喹啉可以抑制RNA酶。后續(xù)加入氯仿，其作用一是與8-羥基喹啉聯(lián)合使用可增強(qiáng)RNA酶抑制作用；二是作為有機(jī)溶劑變性蛋白，使其沉淀并通過離心除去，同時(shí)也通過變性作用抑制RNA酶活性；三是作為溶劑抽提樣品中的脂溶性雜質(zhì)(比如油脂等)，起著一定除雜作用。此法操作簡(jiǎn)單快捷。試驗(yàn)中，樣品在RNAiso Plus中充分被裂解，在加入氯仿離心后，溶液會(huì)形成無色上清層、白色中間層和紅色有機(jī)下面層，收集含RNA的上清層后，經(jīng)異丙醇沉淀便可回收獲得總RNA。利用此法提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR，成功克隆獲得了麻瘋樹oleosin基因長603 bp的cDNA序列，證明RNAiso Plus法提取獲得的總RNA能夠滿足后續(xù)mRNA分離、RT-PCR、麻瘋樹種子相關(guān)基因克隆等分子生物學(xué)試驗(yàn)。

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Study on methods of total RNA isolation from seeds of Jatropha curcas L.

DING Yong, FAN Hong-bo, ZHANG Gao-lei, YAN Yu-ting, LI Rui-yang
(Key Laboratory of Southwest Mountain Forest Resources Conservation and Utilization, Ministry of Education,Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China )

The total RNA from the seeds of Jatropha curcas L.was extracted by using RNAiso Plus method, RNApure Plant Kit method and improved CTAB method, in order to screen out extraction methods of isolating high quality total RNA from the seeds of Jatropha curcas L.The quality of total RNA was examined through OD value and formaldehyde denaturalization agarose gel electrophoresis, the purity and yield of the total RNA were examined by ultraviolet spectrophotometry.The results show that the RNA obtained from the seeds of Jatropha curcas L.with RNAiso Plus method had high purity, quality and yield.The brightness of 28S rRNA was twice of the band of 18S rRNA.The ratio of A260/A280 was 2.030.It was proved that total RNA was intact without degradation and pure without pollution.A partial cDNA with 603 bp length of oleosin gene from Jatropha curcas L.was cloned by RT-PCR with RNA as templates obtained by RNAiso Plus method.The results show that the RNA obtained from the seeds of Jatropha curcas L.with RNAiso Plus method, but not RNApure Plant Kit method and improved CTAB method, had high purity and quality and could be used in molecular biological research, like RT-PCR, RACE-PCR and full-length cDNA cloning directly.

Jatropha (Jatropha curcas L.); seeds; RNA extraction; RT-PCR

S793.2

A

1673-923X(2012)03-0158-04

2011-12-20

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2010Y295)

丁 勇(1979— )，男，安徽霍邱人，碩士，講師，主要從事林木生物技術(shù)方面研究；E-mail：dingyong@swfu.edu.cn

[本文編校：歐陽欽]