吳 碩，傅建敏，烏云塔娜，梁玉琴

柿屬EST-SSR引物設計及遺傳多樣性研究

吳 碩1，傅建敏1，烏云塔娜2，梁玉琴1

(1.中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.中南林業(yè)科技大學 經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004)

利用從NCBI上下載的9 474條EST(Expressed Sequence Tags)序列，設計并開發(fā)EST-SSR引物，用于柿屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究。下載的初始序列拼接成1 390條重疊序列和4 097條無重復序列。用SSRHunter軟件搜索到601條EST序列中含有540個SSR。SSR出現(xiàn)頻率為10.96%，其中以2核苷酸為主。依據(jù)檢出的SSR-ESTs序列設計SSR引物100對，對9個柿屬(Diospyros L.)種質(zhì)資源樣品進行了PCR擴增，其中42對引物有擴增帶，占設計引物的42%，其中30對引物有多態(tài)性，占可擴增引物的71.4%。同時發(fā)現(xiàn)引物15是美洲柿(雄)的特異引物；引物30是青化北野柿的特異標記；引物69和引物80為美洲柿的特異引物；引物99是無核軟棗的特異引物。

柿屬；EST；SSR標記；遺傳多樣性

柿科柿屬Diospyros L.植物為我國重要的經(jīng)濟林資源。其中的柿D.kaki、油柿D.oleifera、君遷子D.lotus[1]等果實及其成分廣泛用于食品、飲料[2]、制藥[3]、工業(yè)[4]等多種行業(yè)，具有良好的生態(tài)效益和經(jīng)濟效益。中國柿屬植物在長期生長進化過程中，由于遺傳變異和自然人工選擇的作用，分化出了許多寶貴的可利用新資源[5]，但對這些寶貴資源的研究，特別是針對各種用途的新品種的選育研究相對滯后。因此利用先進的SSR(Simple senquence repeat，簡單序列重復)分子育種技術(shù)將大大促進柿屬資源新品種的創(chuàng)育效率。但截止至2010年底，國內(nèi)柿屬SSR引物極度缺乏[6]，急需開發(fā)柿屬SSR標記。

隨著近年來cDNA文庫的建立，開發(fā)了大量的EST序列?？焖僭鲩L的ESTs數(shù)據(jù)為SSR標記的開發(fā)帶來了新的契機，已成為了SSR標記的重要來源。EST-SSR技術(shù)是近年來最為常用的SSR引物設計方法，在百合[7]、高丹草[8]、核桃[9]和鐵皮石斛[10]等多個物種中均成功設計出SSR引物，且操作簡便、引物特異性較高，且具有較高的信息量，通用性好。因此本研究應用NCBI上現(xiàn)有的EST數(shù)據(jù)開發(fā)柿屬的引物，輔助柿屬育種及遺傳多樣性研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

9個柿屬植物種質(zhì)資源，分別為湖南烏柿D.cathayensis，浙江野柿D.kaki，青化北野柿D.kaki，青化南野柿D.kaki，浙江柿D.glaucifolia，美洲柿(雌)D.virginiana(female)，美洲柿(雄)D.virginiana(male)，云南野毛柿D.artrotricha，無核軟棗D.lotus。其中美洲柿(雌)和美洲柿(雄)同屬美洲柿種；浙江野柿、青化北野柿和青化南野柿同為野柿；無核軟棗屬于君遷子種。

1.2 引物設計

利用GenBank等數(shù)據(jù)庫中查找并下載柿屬的EST序列[11]，然后用EST-trimmer去除含末端存在的polyA、polyT的“尾巴”結(jié)構(gòu)的序列和用seqclean來屏蔽載體序列。再應用vector NTI軟件進行做EST序列的聚類和拼接[12]，以獲得無冗余EST和盡可能長的重疊序列(contig)。應用SSRHunter軟件[13]查找含SSR的EST序列，查找的標準為2、3、4、5和6核苷酸重復基元的重復次數(shù)分別大于或等于7、5、4、3和3次[14]。應用Primer Premier 5.0[15]和Oligo設計引物，引物長度為18～22 bp，GC%為40%～60% ，擴增產(chǎn)物預期片段為100～350 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

采用CTAB法[16]提取DNA。選擇不同植株的適宜葉片，剪碎后液氮研磨，取100 mg粉末置于1.5 mL離心管中，加入800 μL抽提緩沖液和50 μL巰基乙醇，充分混勻后，65 ℃水浴保溫1 h。冷卻至室溫，在4 ℃低溫離心12 000 r/min，15 min。然后取上清液加入70 μL 5M NaCl，充分搖勻，靜置5 min。再加入700 μL三氯甲烷混合液(三氯甲烷∶異戊醇=24∶1)再次劇烈振蕩混勻后離心，12 000 r/min，12 min 。取上清液重復加入三氯甲烷混合液2～3次至無白色雜質(zhì)產(chǎn)生。再取上清液加入700 μL異戊醇緩慢顛倒至無生白色絮狀沉淀，靜置5～10 min，然后10 000 r/min離心6 min。棄上清液留沉淀，用75%乙醇清洗2遍，每次離心9 000 r/min，6 min。留沉淀，倒置風干至無水珠。再加入 500 μL 1M NaCl，2 μL 10 ng/mL RNA酶，37 ℃水浴1 h。再加入1 000 μL無水乙醇，-20 ℃沉淀2 h。然后1 000 r/min離心6 min，棄上清液，用75%乙醇1 000 μL清洗沉淀，1 000 r/min離心6 min，用無水乙醇清洗沉淀，同樣1 000 r/min離心6 min棄上清液，倒置風干至無水珠。最后加入200 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存。DNA用1.5%瓊脂糖電泳檢測并定量。

1.3.2 PCR擴增和電泳檢測

在前期實驗中我們通過正交試驗對柿屬的SSR反應條件和反應參數(shù)進行了優(yōu)化。最終確定總反應體積為 25 μL，模板 DNA 2 μL，2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)8 μL，10 mmol/L引物(金斯瑞生物公司)各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴增儀型號為S10000(聯(lián)想生物科技有限公司)。參數(shù)為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，51 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增完畢，以1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，對有擴增產(chǎn)物的樣品再用8%PAGE(聚丙烯酰胺)電泳分離，用紫外照相機(Bio-Rad公司)照相并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 柿屬植物SSR引物開發(fā)設計

2.1.1 EST數(shù)據(jù)的取得與前處理

從NCBI等數(shù)據(jù)庫下載柿屬植物的EST序列9 474條。初始EST序列中首先去除小于150 bp的低質(zhì)量片段，再用EST-trimmer去除含末端存在的polyA、polyT的“尾巴”結(jié)構(gòu)的序列317條；用seqclean來屏蔽載體序列，獲得柿屬植物EST序列9 157條。

2.1.2 EST數(shù)據(jù)的聚類和拼接

應用vector NTI軟件進行做EST序列的聚類和拼接后，獲得5 487條有效的EST序列，其中包括1 390條重疊序列contig，為25.3%，4 097條無重復single序列，為74.7%。

2.1.3 EST中SSR序列的發(fā)掘與分析

應用SSRHunter軟件，從5 487條EST序列查找SSR序列，查找的標準為2、3、4、5和6核苷酸重復基元的重復次數(shù)分別大于或等于7、5、4、3和3次。結(jié)果表明，5 487條EST序列中找出601條序列含SSR，SSR檢出率達10.95%。其中二核苷酸重復組合有12種共367條，占61%，二次重復最多的是CT組合，有123條；三核苷酸重復組合有60種共196條，占33%，最多為CTT組合，有15條；四核苷酸重復組合有31種共38條，占6%，最多為CATA組合，為3條(表1 )?？梢奡SR主要屬于二、三核苷酸重復類型，且不同重復基元出現(xiàn)與否及其頻率高低有明顯的偏倚性。也與柿屬現(xiàn)有的EST數(shù)較少、覆蓋度不足。

2.1.4 EST-SSR引物設計

應用Primer5.0和Oligo引物設計軟件，按照引物設計標準，對601條EST序列設計引物。結(jié)果表明共設計出155對合格的SSR引物。從中選取較好的100對引物進行合成，對9個柿屬植物種質(zhì)資源進行多態(tài)性篩選。結(jié)果42對引物有擴增條帶，其中11對擴增出非目的條帶，30對擴增出穩(wěn)定清晰的目的條帶且有多態(tài)性，1對引物有目的條帶但無多態(tài)性。

表1 含SSR序列中重復基元種類數(shù)目Table 1 Repeated types and numbers of SSR sequences

2.2 遺傳多樣性分析

用篩選出的30對引物(表2)對柿屬的9個種質(zhì)資源樣本進行擴增，共獲得143擴增帶，其中142為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例達99.3%，片段長度在100～350 bp之間，平均每對引物約5條帶；其中P15、P30、P69、P78、P80、P89和P99共7對引物均擴增出單一條帶(約占0.7%)。

通過實驗得到5對特異性引物，分別為P15是美洲柿(雄)的特異引物，P30是青化北野柿的特異引物，P80和P69為美洲柿的特異引物，P99只能擴增出無核軟棗(圖1)。

表2 引物序列Table 2 Information of primer pairs

續(xù)表2Continued table 2

柿屬9個樣品聚類后分為6類，見圖2。其中浙江柿明顯與其他柿屬品種親緣關系較遠，表明浙江柿這個種較為特殊，起源較為奇特，很有研究價值。浙江柿、浙江野柿和青化北野柿3個種與其余6種親緣關系較遠。野毛柿、無核軟棗、美洲柿和烏柿間親緣關系較近。除美洲柿兩個品種外，烏柿和青化南野柿親緣關系較近，起源相近。而青化北野柿和青化南野柿雖名字相近，但親緣關系較遠，可能分屬不同的種。美洲柿的雌雄品種同為美洲柿種下的兩個品種，親緣關系較其他種要近。圖中可見其雖有有微小差別，但親緣關系極近，表明此些引物用于鑒定品種間親緣關系準確可靠。

3 討 論

近年來，公共數(shù)據(jù)庫中EST數(shù)量的劇增，為SSR標記的開發(fā)提供了一條快速而有效的途徑。柿屬在NCBI上共有9 474條EST序列，相較于其他種屬來說數(shù)據(jù)量較少。下載的EST拼接為5 487條序列，共查找出601條含SSR序列，SSR檢出率達11.9%。高于水稻的4.7%[17]，而低于茶樹的15.48%[18]。表明不同的物種和不同的搜索條件會產(chǎn)生不同的結(jié)果。同時也表明初始數(shù)據(jù)量的多少與SSR的檢出率無關。

查詢出的柿屬SSR主要屬于二、三核苷酸重復類型，高階核苷酸組合極少，表明不同重復基元出現(xiàn)與否及其頻率高低有明顯的偏倚性。如果EST數(shù)足夠大且無偏倚性，則4種不同的堿基隨機組合將產(chǎn)生單核苷酸2種、二核苷酸4種、三核苷酸10種，四核苷酸33種，五核苷酸102種和六核苷酸350種基本重復類型[19]。而本實驗中的重復種類明顯少于理論值，這或許與柿屬現(xiàn)有EST數(shù)較少、覆蓋度不足有關。

篩選出來的30對引物的擴增位置主要處于CDS區(qū)域，僅有3對引物來源于5'UTR，表明SSR序列存在于基因的不同部位表現(xiàn)出差異性，或許還表明位于CDS的引物相較5’UTP和3’UTP更易產(chǎn)生擴增，均表現(xiàn)了引物的選擇有其偏好性。

通過對9個柿屬種質(zhì)資源的聚類分析，發(fā)現(xiàn)浙江柿與其余8個樣品親緣關系較遠，可能有不同的起源。同時結(jié)果表明美洲柿雌雄品種間親緣關系最近，符合事實情況，表明實驗結(jié)果真實可靠。本試驗確定了柿屬常見種的親緣關系，這對于加速柿屬EST資源的開發(fā)利用、豐富其分子標記類型、遺傳資源評價、繪制遺傳圖譜和實現(xiàn)特定性狀的輔助選擇等研究都具有重要的意義。

圖1 特異性引物標記Fig.1 Special makers

圖2 9個柿屬種質(zhì)資源樣品聚類分析Fig.2 Dendrogram of 9 germplasm resources of Diospyros L.

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Study on EST-SSR primer design and genetic deversity of Diospyros L.

WU Shuo1, FU Jian-min1, WUYUN Ta-na2, LIANG Yu-qin1
(1.Non-timber Forest Research and Development,Center of Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China;2.The Key Lab of Non-wood Forest Product of Forestry Ministry, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The 9 474 ESTs of Diospyros L.in the database of NCBI were downloaded, then were used to design EST-SSR makers.The obtained makers were used to analyze diversity of 9 germplasm resources (Diospyros L.).The 9 474 ESTs after some redundants and some low qualities were removed, finally assembled into 1 390 contigs and 4 097 singles.Then by using SSRHunter software, 540 SSRs in 601 ESTs were found, accounting for 10.96% of ESTs, and most of them were dinucleotides.One hundred primer pairs were designed for polymorphism analysis in 9 genotypes(Diospyros L.).Forty two primer pairs showed the amplification, accounting for 42% of designed primers, and 30 primer pairs showed polymorphisms, accounting for 71.4% of primers available.Meanwhile, P15 was special primer of D.virginiana(male), P30 was special primer of north Qinhua-D.spp., P69 and P80 were special primers of D.virginiana, P99 were special primers of D.lotus.

Diospyros L.; EST; SSR maker; genetic diversity

S718.46

A

1673-923X(2012)03-0152-06

2012-01-06

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(200904041)

吳 碩(1985—),女,河北石家莊人,碩士研究生,研究方向為經(jīng)濟林遺傳育種;E-mail：snow-shuoer@163.com

傅建敏(1963—),女,河南禹州人,副研究員,主要從事經(jīng)濟林育種與栽培的研究;E-mail：fjm371@163.com

[本文編校：吳 毅]