馮金玲，楊志堅，陳 輝

油茶芽苗砧嫁接體愈合過程AFLP分析

馮金玲，楊志堅，陳 輝

(福建農(nóng)林大學(xué)， 福建 福州350002)

為了探討油茶芽苗砧嫁接體愈合過程中嫁接口和接穗是否發(fā)生基因變化，利用AFLP對不同發(fā)育階段的油茶芽苗砧嫁接口，油茶芽苗砧愈傷口以及接穗母樹、砧木和接穗萌發(fā)芽的基因進行分析。結(jié)果表明：油茶芽苗砧嫁接口發(fā)育過程中，條帶數(shù)變化相對比較大，特別是在嫁接移栽后的第 4、16、24、35 天，愈傷口條帶數(shù)的變化是在移栽后第 0 天至第 18 天間；接穗母樹、接穗萌發(fā)芽和砧木存在 13 條特異帶，10 條在接穗萌發(fā)芽DNA 中存在，其中 5 條為接穗萌發(fā)芽特有條帶，5 條在砧木莖中存在。

油茶；芽苗砧嫁接；基因；AFLP

油茶Camellia oleifera 是我國重要的木本油料樹種，已有 2 300 多年的栽培歷史[1]。大力發(fā)展油茶生產(chǎn),不僅是生態(tài)環(huán)境建設(shè)的需要,而且是不斷滿足人們生活所需和調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟、增加農(nóng)民收入的重要途徑[2]。油茶芽苗砧嫁接具有操作簡單、繁殖系數(shù)大、結(jié)實早、能保持母樹優(yōu)良性狀等優(yōu)點，在油茶生產(chǎn)中是良種繁育的主要途徑[3]。嫁接是否引起植物基因變化目前存在兩種看法，一種認為嫁接不會引起植物基因的變化。如周瑞金等人運用攜帶外源基因nptⅡ的蘋果品種接體和未進行基因轉(zhuǎn)化的蘋果組培苗作砧木, 通過試管微嫁接，檢測結(jié)果表明外源nptⅡ基因只在轉(zhuǎn)化植株體內(nèi)表達, 而不通過嫁接在接穗和砧木間進行傳導(dǎo)[4]。另一種觀點認為嫁接能引起植物變異。如Hirata等人在辣椒嫁接實驗中認為，嫁接能誘導(dǎo)辣椒嫁接植株性狀產(chǎn)生變異，包括果形、株型以及辣椒素含量等，并能穩(wěn)定遺傳27代[5-7]。迄今為止，尚未見到芽苗砧嫁接是否引起嫁接體基因變化的研究報道。為此，本實驗運用AFLP方法[8-10]，分析油茶芽苗砧嫁接體愈合過程中接穗和砧木是否發(fā)生基因變化，旨在判斷芽苗砧嫁接能否保持接穗的優(yōu)良品質(zhì)和探索一種快捷育種方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

2009 年6月2日于田間實驗室進行油茶芽苗砧嫁接。砧木的種子來源于福建省桐口林場的優(yōu)良無性系，砧木莖段截留1.5 cm，根部留6 cm左右；接穗取自同一株優(yōu)樹上健壯的半木質(zhì)化的當年生枝條，長2 ～ 3 cm，一芽一葉。取10g左右的接穗莖和砧木莖，保存于 -80 ℃ 冰箱。對照實生苗與砧木進行相同的截莖斷根處理。處理后立即栽植于預(yù)先整好的苗床。株行距3 cm× 10 cm。栽植時壓實土壤，籽粒露在畦面，澆透水，蓋上白色透明塑料薄膜。棚內(nèi)的溫度保持在28 ～ 30 ℃。

6月2日實驗處理后移栽至第26 天每 2 d取1次樣，共取14次；至第35 天每隔3 d取1次樣，共3次；至第45 天每隔5 d取1次樣，共2次；至第55 天隔10 d取1次，共1次，合計取20次樣，每次都采用完全隨機方法進行取樣。取樣后植株在流水中清洗干凈，截取油茶芽苗砧嫁接苗的嫁接口和實生苗的愈傷口1 ～ 1.5 cm 的莖段以及萌發(fā)的接穗芽（見表1），保存于 -80 ℃ 冰箱。

1.2 DNA提取

每個處理隨機抽取 15 株，約1.5g的材料，用CTAB 法提取總 DNA[11-12]，上海生工的DNA純化試劑盒純化 DNA，測定DNA 濃度，并用1%Agarose膠檢測 DNA 的質(zhì)量。稀釋至 20 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 AFLP分析

設(shè)計選取 8 對引物組合（見表2）進行檢測。EcoR I 和 Mse I 兩種限制性內(nèi)切酶、EcoRI和MseI 接頭、引物、T4-DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶及 DNA ladder marker 均購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司。

表1 參試材料編號?Table 1 Numbers of the materials in experiment

表2 油茶AFLP 引物序列Table 2 AFLP primers sequences of Camellia oleifera

1.3.1 酶 切

選取 EcoR I／Mse I 酶切組合。酶切反應(yīng)體系 20 μL，EcoRI 為1 U，MseI為3 U，DNA 為150 ng，混勻后 37 ℃ 水浴 8 h，酶切后，80 ℃ 水浴 10 min 滅活。

1.3.2 連 接

反 應(yīng) 體 系 20 μL，DNA 酶 切 液 10 μL，EcoRI 接頭和 MseI 接頭各 5 pmol，T4-DNA 連接酶 7 U，10 mmol·L-1ATP 0.2 mmol/L，1 μL 5× 酶切連接緩沖液。上述混合液 16 ℃ 保溫過夜，連接結(jié)束后，80 ℃ 水浴 10 min 滅活，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 預(yù)擴增

反應(yīng)體系 20 μL，DNA 連接液 4 μL，dNTP 終濃度為 0.2 mmol·L-1，Primer E-A 為 2 pmol，Primer M-C 為 1 pmol，Mg2+終 濃 度 為 2.5 mmol·L-1，rTaq聚合酶 1.5 U?；靹蚝笤?Eppendor 梯度 PCR儀上進行擴增。程序為 95℃ 4 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán) 30 次，最后 72℃再延伸 10 min。PCR 后吸取 10 μL 預(yù)擴增產(chǎn)物和 2 μL Loading buffer 混合，在 2 % 瓊脂糖凝膠中檢測預(yù)擴增的效果，剩余的預(yù)擴增產(chǎn)物置于-20 ℃ 冰箱保存。

1.3.4 選擇性擴增

反應(yīng)體系20 μL，取5 μL稀釋60倍的預(yù)擴增產(chǎn)物，Primer E-ANN為8 pmol，Primer M-CNN為 3 pmol，dNTP 終濃度為 0.2 mmol·L-1，Mg2+終濃度為2.5 mmol·L-1，rTaq聚合酶1.5 U。混勻后在Eppendor 梯度 PCR 儀上進行擴增。程序為95℃ 4 min，而后按照95℃ 30 s，65℃ 30 s(每個循環(huán)降低 0.7 ℃ )，72 ℃ 1 min，循環(huán)12次，再按照95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)23次，最后72℃延伸10 min。PCR 后吸取 10 μL 預(yù)擴增產(chǎn)物和 2 μL Loading buffer 混合，在 2 % 瓊脂糖凝膠中檢測選擇性擴增效果。

1.3.5 結(jié)果檢測

選擇性擴增產(chǎn)物與加樣緩沖液等體積混合液，95 ℃ 變性 6 min，置冰上冷卻，吸取 3.5 μL 混合液上樣，在 85 W 下用 6% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳至二甲苯青離底部 1～2 cm 時停止，分離擴增產(chǎn)物，銀染檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

人工記錄電泳條帶，根據(jù)DNA電泳分子量標準（Marker）計算出各片段的大小，按擴增條帶的有無分別計為1和0，形成數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP引物篩選

本實驗用 8 個 EcoRI 引物和 8 個 Mse I 引物組合成 64 對 AFLP 引物（見表3），以 1 號材料的DNA 為模板進行擴增。擴增產(chǎn)物用6 % 變性聚丙烯酰胺凝膠進行檢測，結(jié)果見圖 1。本實驗產(chǎn)生的AFLP 聚丙烯酰胺凝膠圖 200 bp 以下的條帶發(fā)虛，因此選擇分析的條帶在 200～500 bp 之間。由表3可得，不同引物產(chǎn)生的條帶數(shù)差異很大，在 15～48 條之間，其中 E5M4 組合引物產(chǎn)生的條帶最小，15 條；而 E1M6 組合引物卻產(chǎn)生了 48 條引物。同時不同引物組合擴增的效果也不同，因此選擇條帶清晰、且穩(wěn)定性和多態(tài)性好的引物組合。結(jié)合擴增的條帶性和效果，本實驗選擇 E1M1 和 E1M6 兩對引物組合。

表3 AFLP-PCR 引物擴增的結(jié)果統(tǒng)計Table 3 The results of the primes AFLP-PCR amplification

圖1 引物篩選變性聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.1 The primers screening tested by denatured polyacrylamide gel electrophoresis

2.2 嫁接體愈合過程AFLP分析

愈合過程中的嫁接口和愈傷口AFLP選擇性擴增圖譜見圖2。樣品號 1～20 為油茶芽苗砧嫁接口發(fā)育過程的材料。由表 4 可見，在 E1M1 的引物組合中，條帶數(shù)變化較大，其中條帶數(shù)最少的是在樣品 8和 9 中，為 43條；而在樣品 13、17 和 18 中條帶數(shù)最多，為 48 條；帶數(shù)變化最大是在樣品 3 號與樣品 4 號之間，為3 條。在 E1M6的引物組合中，條帶數(shù)變化較小，在 28 ～ 31 之間，呈緩慢上升后下降，其變化分別在樣品7、樣品9和樣品17中。綜合以上可見，在油茶芽苗砧嫁接愈合過程中，嫁接口的基因存在變化，而且在樣品 3、樣品 9、樣品 13 以及樣品 17 即嫁接移栽后的第 4 天 、第 16 天第 24 天及第 35 天可能是油茶芽苗砧嫁接愈合的關(guān)鍵時期。

圖2 E1M1和E1M6 引物對愈合過程中的油茶芽苗砧嫁接口 AFLP 選擇性擴增圖譜Fig.2 Map of AFLP selection amplification in prime E1M1and E1M6 for development of Camellia oleifera nurse seed grafted union

表4 引物對愈合過程中的油茶芽苗砧嫁接口擴增的條帶數(shù)Table 4 The bands amplified by AFLP primers among development of Camellia oleifera nurse seed grafted union

樣品號 21～38 是油茶芽苗砧愈傷處理后愈合過程的材料。由表 4 可見，雖然在 E1M1 的引物組合中存在 3 個條帶數(shù)的變化，其變化是在樣品 21 至樣品 29 之間即移栽后第 0 天 至第 18 天間，有可能此期是油茶芽苗砧愈傷口愈合的過程。但在 E1M6 的引物組合中沒有條帶數(shù)的變化。

2.3 接穗萌發(fā)芽AFLP分析

樣品 39、40 和41 分別代表著接穗母樹莖、接穗萌發(fā)芽和砧木莖。由圖3可見，在 E1M1 的引物組合中，接穗萌發(fā)芽的條帶數(shù)為51，比接穗母樹莖的條數(shù)帶多6 條，比砧木莖條帶數(shù)多2 條。在 E1M6 的引物組合中，接穗萌發(fā)芽的條帶數(shù)為30，比接穗母樹莖的條數(shù)帶多2 條，比砧木莖條帶數(shù)多1 條?？傊邨l帶數(shù)大小排序分別為：接穗萌發(fā)芽、接穗母樹莖、砧木莖。

圖3 E1M1和E1M6 引物對接穗萌發(fā)芽 AFLP 選擇性擴增圖譜Fig.3 Map of AFLP selection amplification in prime E1M1 and E1M6 for the buds from the scion

從表5可得在接穗母樹莖、接穗萌發(fā)芽和砧木莖中總共有13條特異條帶。10個特條帶在接穗萌發(fā)芽的DNA中存在，接穗母莖DNA中不存在，其中有5條在砧木莖DNA中存在，剩余的5條是接穗萌發(fā)芽特有的條帶。剩下的3條特異帶，1條為接穗母樹莖特有條帶；1條為砧木莖特有條帶；1條在接穗萌發(fā)芽的DNA中不存在，但在接穗母莖和砧木莖DNA中存在。

表5 2對引物在材料39、40和41中的AFLP特異帶Table 5 Data of the AFLP specific bands with 2 pairs of AFLP primers among material from 39 to 41

3 討 論

DNA 是遺傳信息的載體，信息包含于 DNA的堿基排列順序之中。DNA 分析技術(shù)在原理上可大致分為兩大類，一類是直接測序，分析一些特定基因或DNA 片段的核苷酸序列，度量這些片段DNA 的變異性；另一類是檢測基因組的一批識別位點，從而估測基因組的變異性[13]。AFLP就是作為一種行之有效的通過檢測基因組識別位點來判斷基因組變化的分子標記。一條AFLP帶的“有”或“無”反映了這一位點的 DNA 序列的差異[14]。AFLP 分析中，每一條擴增帶對應(yīng)著基因組 DNA分子上的一個位點。樣品之間帶型的差異反映了DNA 水平上酶切位點分布的差異，所以可將每一擴增片段看作基因組的一個特征，而且這種特征數(shù)目不受環(huán)境條件的影響，非常穩(wěn)定可靠[15]。

嫁接愈合是異種植物或同種植物的細胞、組織或器官相互影響與作用結(jié)合成一個有機整體的過程。愈合的過程一般都經(jīng)歷隔離層形成期、愈傷組織分化增殖期、形成層分化與連接期及輸導(dǎo)組織分化與連接期這4個階段[16-17]。油茶芽苗砧嫁接口在愈合過程中AFLP 的條帶數(shù)發(fā)生變化，特別是在嫁接移栽后的第 4 天 、第 16 天、第 24天及第 35 天，但油茶芽苗砧愈傷口的條帶數(shù)在移栽后第 0 天至第 18 天間發(fā)生變化，有可能是嫁接口和愈傷口在階段性的發(fā)育中基因組發(fā)生了甲基化。DNA甲基化水平在愈傷中最低，再生過程上升[18]。因此在嫁接移栽后的第4 天，嫁接口的總DNA條帶數(shù)最少，為72條，此階段有可能是愈傷組織分化增殖期；而接移栽后的第35天，嫁接口的總DNA條帶數(shù)最多，為79條，此階段有可能是輸導(dǎo)組織分化與連接期。在植物發(fā)育過程中原始DNA 序列并未改變，而是基因組DNA序列以外的因素調(diào)控特定基因表達，當基因處于表達水平時，甲基化狀態(tài)一般較低，而生長發(fā)育需要關(guān)閉時，就會發(fā)生重新甲基化，抑制轉(zhuǎn)錄并終止其表達[19]。這正好說明了AFLP條帶數(shù)的波動變化。同時DNA甲基化水平可能與形態(tài)建成相關(guān)，隨著年齡增加，DNA甲基化水平呈上升趨勢[20]，因此無論是嫁接口還是愈傷口的愈合過程，AFLP條帶數(shù)雖波動變化，但總體上升。

接穗萌發(fā)芽DNA 中11條特異條帶，5條為接穗萌發(fā)芽特有條帶，5條在砧木莖中存在，1條在接穗萌發(fā)芽DNA 中不存在，在接穗母樹莖和砧木莖的DNA都有存在。接穗萌發(fā)芽特異條帶的變化可能存在三種原因，一種原因可能是DNA發(fā)生了甲基化，從而調(diào)控在嫁接口愈合背景下接穗芽的發(fā)育；另外一種原因可能是接穗和砧木存在著基因的交流。陳紅和王永清[21]在番茄自體嫁接與番茄與茄子的異種嫁接的接合部中均出現(xiàn)了特征帶,認為嫁接接合部愈傷組織細胞間的相互作用導(dǎo)致了一定的遺傳變異的結(jié)果類似。李明和姜世玲等[23]也認為基因可以通過嫁接面在擬南芥體內(nèi)雙向傳遞[22]。嫁接體的砧木與接穗的 DNA 發(fā)生交流其原理可能是在木質(zhì)化和死亡的細胞中，DNA 穿過細胞壁和細胞間隙向維管束轉(zhuǎn)移，通過維管束砧木與接穗的 DNA 發(fā)生了轉(zhuǎn)移，并在植株生長點先整合。最后一種可能是接穗受到嫁接引起的環(huán)境壓力的影響，活化了轉(zhuǎn)座子，而引起變異[24]。

接穗萌發(fā)芽DNA特異條帶的出現(xiàn)是由甲基化，或者嫁接壓力引起芽變異，或者嫁接愈合過程中接穗和砧木基因交流引起，還是三者共同作用或其它原因引起的需作進一步研究。同時還需進一步研究接穗萌發(fā)芽DNA的特異條帶，是引起什么功能基因變化，這種變化能否穩(wěn)定遺傳。如果可以穩(wěn)定遺傳又如何做選擇性育種。

[1] 周素梅，王 強.我國茶籽資源的開發(fā)利用及前景分析[J].中國食物與營養(yǎng)，2004,(3)：13-16.

[2] 袁德義,彭邵鋒,鄒 鋒,等.油茶種子脂肪酸與游離氨基酸的分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2011,31(1)：77- 79

[3] 范成民,董麗芬,朱 幟,等.核桃芽苗砧嫁接方法研究[J].西北林學(xué)院學(xué)報,2008, 23 (4)： 109-111.

[4] 周瑞金，杜國強，師校欣.標記基因nptⅡ在轉(zhuǎn)基因蘋果嫁接砧穗間無相互傳導(dǎo)[J].園藝學(xué)報，2006,33 (6)：1329-1330.

[5] Yagishita N, Hirata Y, Mizukami H, et al.Genetic nature of low capsaicin content in the variant strains induced by grafting in C.arnuum L.Euphytica[J].Arnuum L.Euphytica,1990, 46：249-252.

[6] Taller J, Hirata Y, Yagishita N, et al.Graft-induced genetic changes and the inheritance of several characteristics in pepper(Capsicum annuum L.) [J].Theor.Appl.Genet.,1998, 97：705-713.

[7] Taller J,Yagishita N, Hirata Y.Graft-induced variants as a source of novel characteristics in the breeding of pepper (Capsicum annuum L.) [J].Euphytica,1999, 108：73-78.

[8] Clement D,Risterucci A M, Motamayor J C,et al.Mapping quantitative trait loci for bean traits and ovule number in Theobroma cacao L.[J].Genome,2003, 46(1)：103-111.

[9] 侯文秀，李景富，劉劍峰，等.番茄成熟突變體rin 基因的AFLP 分子標記[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010,41(2)：20-24.

[10] 孟慶文，崔衛(wèi)東，白光強，等.紅景天種內(nèi)遺傳多樣性分析AFLP 方法建立[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,45 (1)：88-92.

[11] 彭邵鋒,張黨權(quán),陳永忠,等.14個油茶良種遺傳多樣性的SRAP分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，,2011,31(1)：80- 85.

[12] 周李華，趙超藝，羅軍武，等.茶樹種質(zhì)資源AFLP分析中DNA模板快速制備方法[J].食品科學(xué)，2007,28(2)：193-195.[13] 李 璇，王曉東.AFL P 的研究[J].甘肅教育學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版 )，2004,18(1)：58-61.

[14] 鄧建云，李建強，黃宏文.一株具有特異AFLP指紋圖譜的杜仲古樹[J].武漢植物學(xué)研究，2006,24(6)：509-513.

[15] 蒲娜娜，杜國強，李明媛，等.7 種SH 系蘋果砧木的AFLP分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2007,23(6)：141-144.

[16] 胡艷青，蘇 媛，韓風(fēng)葉，等.嫁接黃瓜在愈合過程中的解剖觀察和抗氧化酶活性的變化研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007,28(3)：224-230.

[17] 黃堅欽，章濱森，陸建偉，等.山核桃嫁接愈合過程的解剖學(xué)觀察[J].浙江林學(xué)院學(xué)報，2001,18(2)：111-114.

[18] 孟海軍.柑橘胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化/去甲基化研究及SSR標記開發(fā)[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006：16-25.

[19] Wassenegger M.RNA-directed DNA methylation[J].Plant Mol.Biol., 2000, 43：203-220.

[20] Xu M L, Li X Q, Korban S S.DNA-methylation alterations and exchanges during in vitro cellular differentiation in rose(Rosa hybrida L.) [J].Theor.Appl.Genet.,2004, 109(5)：899-910.

[21] 陳 紅，王永清.番茄與茄子嫁接接合部愈傷組織的RAPD分析[J].園藝學(xué)報，2006,33(3)：565-565.

[22] 李 明，姜世玲，王幼群，等.基因轉(zhuǎn)錄后沉默信號可以在擬南芥嫁接體內(nèi)快速雙向傳遞[J].科學(xué)通報, 2006,51(2)：142-147.

[23] Ohta Y.Graft-transformation, the mechanism for graft-induced genetic changes in higher plants [J].Euphytica,1991, 55：9l-99.

[24] Dan-Hua Z,Zhao-Huang M,Wei-Ming X,et al.Graft-induced inheritale variation in mungbean and its applocation in mungbean breeding[J].Acta Botanica Sinica,2002, 44(7)：832-837.

AFLP analysis of nurse seed grafted union in Camellia oleifera during healing

FENG Jin-ling, YANG Zhi-jian, CHEN Hui
(Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China)

To investigate whether gene changes of the nurse seed grafting union and the scion during healing of the nurse seed grafted union in Camellia oleifera.The differences of development between the nurse seed grafting unions in Camellia oleifera and the healing wound, the mother tree of the scion, the root stock and the buds from the scion were examined by AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) technology.The results show that the number of bands changed relatively during the development of the nurse seed grafting union, especially at the days 4th, 16th, 29th and 35th after grafting; the change in number of bands during the development of the healing wound took place at the days 0～18th after transplantation.There were 13 specific bands in the gene among the scion, the root stock and the buds from the scion.Of them, 10 bands belonged to the buds from the scion DNA, 5 bands of which only belonged to it, the rest bands were found on both it and the root stock.The band change of the nurse seed grafting may caused by DNA methylation.The changes of the scion may resulted from DNA methylation, or affected by the pressure of the graft, may gene exchanged between the scion and the root stock.The real causes of the changes will be studied furtherly.

Camellia oleifera; nurse seed grafting; gene; AFLP

S794.4

A

1673-923X(2012)03-0141-06

2011-10-27

科技人員服務(wù)企業(yè)行動項目(2009GJC40006)；福建省科技平臺建設(shè)項目(2010N2001)

馮金玲(1978—)，女，福建尤溪人，講師，博士，主要從事經(jīng)濟林生物學(xué)研究

陳 輝(1957—)，男，福建福州人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事森林培育學(xué)研究；E-mail：zjchchenh@163.com

[本文編校：謝榮秀]