吳 田，沈曉進(jìn) ，李法營(yíng) ，韋玲長(zhǎng) ，藍(lán)增全

雙江古茶樹與云南大葉種茶群體品種間的ISSR分析

吳 田1，沈曉進(jìn)2，李法營(yíng)3，韋玲長(zhǎng)4，藍(lán)增全3

（1.西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.昆明市農(nóng)科院生物所，云南 昆明 650034；3.西南林業(yè)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650224；4.臨滄茶葉科學(xué)研究所，云南 臨滄 677000）

采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)云南17份茶樹樣品進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，12條ISSR引物共產(chǎn)生193條擴(kuò)增帶，其中多態(tài)性條為100.0%。供試材料的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.50～0.88。通過(guò)UPGMA法，可將17份材料分為2個(gè)大類，第1大類為“紅毛茶”，第2大類又可分成2個(gè)亞組，其中組Ⅰ包括雙江古茶樹和永德大葉種，而組Ⅱ包括勐庫(kù)群體品種、勐海大葉種和部分鳳慶大葉種。聚類分析結(jié)果表明，雙江古茶樹與采自永德的茶樹親緣關(guān)系最近，而與采自勐海和鳳慶大葉種的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

大葉茶；種質(zhì)資源；ISSR標(biāo)記

云南大葉種茶是云南省大葉類茶樹品種的總稱，其代表是經(jīng)國(guó)家認(rèn)定的勐庫(kù)大葉種、鳳慶大葉種和勐海大葉種。據(jù)國(guó)家、省、地茶葉學(xué)者專家科考組2002年12月的初步結(jié)論，樹齡2 700多年的雙江自治縣勐庫(kù)野生古茶樹群落，是迄今世界上已發(fā)現(xiàn)的海拔最高、分布面積最廣、種群密度最大的野生古茶樹群落。其中，1號(hào)大茶樹位于海拔2 720 m處，株高16.8 m，基圍3.25 m，胸圍3.1 m，樹幅13.7×10.6 m；另外一棵根基和株高都在1號(hào)大茶樹之上的古茶樹，因?yàn)檫@棵茶樹是在考察組對(duì)古茶山科考后才發(fā)現(xiàn)的，先前就命名了1號(hào)大茶樹，所以，便稱它為 1+1號(hào)大茶樹。近年來(lái)，雖然有不少報(bào)道是關(guān)于茶樹親緣關(guān)系的研究，但鮮有探討雙江古茶樹與云南大葉群體品種間親緣關(guān)系的的研究。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于PCR的分子標(biāo)記如RAPD、AFLP 、SSR、ISSR等，被廣泛應(yīng)用于植物遺傳研究[1-2]。ISSR 標(biāo)記是采用17～22堿基的重復(fù)錨定引物擴(kuò)增重復(fù)序列之間的片段，操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富[3]，且一套ISSR引物可在多種作物中通用，利用率高，在遺傳關(guān)系研究方面的應(yīng)用前景更廣闊[4]。用ISSR標(biāo)記進(jìn)行茶樹進(jìn)行分子鑒別的報(bào)道逐漸增多[5-7，8]。本實(shí)驗(yàn)采用ISSR技術(shù)探討雙江古茶樹與云南大葉群體品種間的親緣關(guān)系，以在今后育種及分類工作中在DNA水平提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

樣品主要采集自勐庫(kù)、鳳慶、勐海等3個(gè)茶區(qū)，葉面積、葉形指數(shù)、葉脈數(shù)、葉片特點(diǎn)、葉片顏色等特征詳見(jiàn)表1。表1中的名稱大多根據(jù)采集地命名，如“勐庫(kù)”為勐庫(kù)群體栽培品種，采集自勐庫(kù)；“鳳慶1”、“鳳慶2”分別為采集自鳳慶不同地點(diǎn)的兩份材料。古茶樹1～4均采自雙江勐庫(kù)鎮(zhèn)大雪山，其中“古茶樹2”為1號(hào)大茶樹，“古茶樹4”為1+1號(hào)大茶樹，而“古茶樹1” 和“古茶樹3”為1號(hào)大茶樹附近、植株較為矮小的、形態(tài)特征略有差異的茶樹樣品。古茶樹1、2、3和4即為本實(shí)驗(yàn)所要探討的雙江古茶樹。而“紅毛茶”是當(dāng)?shù)卣J(rèn)為是“野茶”的一種資源，且有研究者認(rèn)為其與雙江古茶樹有一定的淵源，但目前還未見(jiàn)其進(jìn)行詳細(xì)的分類鑒定的資料。樣品選無(wú)病蟲害的茶樹嫩葉，洗凈后擦干，用液氮速凍，置于-70℃冰箱備用。

表1 用于本研究的云南大葉種茶種質(zhì)?Table 1 Yunnan big-leaf tea germplasm resources used in the present study

1.2 主要試劑

CTAB提取介質(zhì)：200 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0)，l00 mmol/L EDTA(pH 值 8.0)，200 mmol/L NaCl；CTAB抽提緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl(pH 值 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，350 mmol/L NaCl，3 % CTAB，2% β-巰基乙醇；SDS提取介質(zhì)：100mmol/L(pH8.0)Tris-HCl，50 mmol/L EDTA (pH值8.0)，500 mmol/L NaCl。本實(shí)驗(yàn)所使用的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 DNA提取

本實(shí)驗(yàn)用改良CTAB法提取DNA，即稱取保存于-70 ℃冰箱茶樹葉片于液氮中迅速研成粉末，取約0.2 mg轉(zhuǎn)入2.0 mL 離心管中，加入1 mL CTAB提取介質(zhì)，混勻，7 000 r/min離心5 min，除去上清；重復(fù)上述操作；在沉淀中加入1 m L 65℃的CTAB抽提緩沖液，混勻，65 ℃水浴1 h；7 000 r/min離心10 min，取上清液，轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)混合液，充分混勻，至水相由綠色變?yōu)闊o(wú)色；10 000 r/min離心10 min，取上清液，轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2倍體積-20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕柔混勻；10 000 r/min離心10 min，將上清液緩慢倒出，用75%乙醇浸泡沉淀1 h后在超凈工作臺(tái)吹干至無(wú)酒精味，溶于適量1×TE緩沖液。

1.4 DNA檢測(cè)

取5 μL DNA樣品與3 μL上樣緩沖液(loading buffer)混勻后點(diǎn)樣于1% EB瓊脂糖膠孔，電泳，用凝膠成像系統(tǒng)照相，保存，以檢測(cè)DNA樣品的完整性。根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果大致判斷DNA濃度，將DNA稀釋至合適倍數(shù)，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280、OD260/OD230和DNA樣品濃度，以檢測(cè)DNA樣品的純度和濃度。

1.5 ISSR引物篩選及ISSR-PCR擴(kuò)增

根據(jù)加拿大British Columbia大學(xué)設(shè)計(jì)的ISSR引物序列，隨機(jī)選擇32條，由上海生工合成。PCR試劑均購(gòu)自日本TAKARA公司。PCR反應(yīng)液體系為20 μL，含10×PCR Buffer 2 μL，dNTP(A、T、C、G) 各 200 μmol/L，每條引物 1 μL (10 mmol/L)，Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA 50 ng(提取自“紅毛茶”)，不足體積用無(wú)菌超純水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；50 ～ 60 ℃（根據(jù)引物合成單上的Tm值分別試驗(yàn)，取最佳退火溫度） 45 s；72 ℃ 1 min 30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE緩沖系統(tǒng)下用2.0%的加入溴化乙錠(EB)瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳完畢后在美國(guó)UVP凝膠成像系統(tǒng)上照像并保存。每組引物重復(fù)3次，以確認(rèn)易于辨認(rèn)、清晰且重復(fù)性好的條帶。

1.6 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)電泳條帶的有無(wú)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，在相同遷移位置，有帶記為1，無(wú)帶記為0。只記錄易于辨認(rèn)、清晰且重復(fù)性好的條帶，排除模糊不清的條帶。用NTsys 2.1e軟件對(duì)茶樹種質(zhì)進(jìn)行非加權(quán)組平均法UPGMA(Unweighted Pair Group Method Analysis)聚類分析，計(jì)算種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)，建立樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA質(zhì)量檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用改良CTAB法提取的云南大葉種茶樹葉片基因組DNA用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖片未顯示)，結(jié)果顯示DNA主帶清晰明亮，條帶整齊，無(wú)拖帶現(xiàn)象。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，DNA的OD260/OD280值在1.7～1.9之間， OD260/OD230值在1.9～2.1之間，表明該方法提取的總DNA質(zhì)量比較高，純度好，可以用于后續(xù)ISSR分析。

2.2 ISSR引物的篩選

以“紅毛茶”基因組DNA為模板，對(duì)32條不同的隨機(jī)引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增(圖1)，發(fā)現(xiàn)有12條引物在相應(yīng)的退火溫度下(表2)能擴(kuò)增出產(chǎn)物，其中引物840、844、847、848、866、856、827擴(kuò)增的條帶清晰，且多態(tài)性較高。

表2 用于本研究的ISSR引物Table 2 ISSR primers used in the study

圖1 ISSR引物篩選Fig.1 Selection of ISSR primers

2.3 不同大葉茶種的ISSR-PCR擴(kuò)增

分別用12個(gè)引物對(duì)17份樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明擴(kuò)增的條帶大部分集中在100～1 000 bp，可讀條帶數(shù)共193條，多態(tài)性比率為100.0%。圖2以引物847為例展示了其在17份樣品中擴(kuò)增的圖片。

圖2 引物847的ISSR擴(kuò)增Fig.2 Agarose gels showing the ISSR profile generated by primer 847

2.4 聚類圖的構(gòu)建

采用UPGMA法構(gòu)建了17份樣品的遺傳關(guān)系聚類圖(圖3)。通過(guò)聚類發(fā)現(xiàn)，17份樣品的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.50～0.88，其中紅毛茶單獨(dú)聚類，與其它16份種質(zhì)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。其余的16份種質(zhì)明顯聚為兩組(組Ⅰ和組Ⅱ)，組Ⅰ包括采集自勐庫(kù)的種質(zhì)和部分采集自永德的種質(zhì)，而組Ⅱ包括勐庫(kù)群體品種“勐庫(kù)”、采集自勐海的種質(zhì)和采集自鳳慶的種質(zhì)。特別值得注意的是，古茶樹1、2、3和4，即雙江古茶樹聚類較近，表明了它們較近的親緣關(guān)系。而雙江古茶樹與“勐庫(kù)”分別位于聚類圖的兩組中，且“勐庫(kù)”與鳳慶種親緣關(guān)系最近，暗示著勐庫(kù)群體品種并非源于當(dāng)?shù)?。此外，通過(guò)聚類圖還可以發(fā)現(xiàn)，古茶樹1和古茶樹3遺傳距離最小，表明兩者之間親緣關(guān)系最近，且在本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)記范圍內(nèi)、相似性系數(shù)為0.88時(shí)，這兩種種質(zhì)在DNA分子水平上是相同的，表明單純從表觀性狀進(jìn)行分類是有失偏頗的，更加暗示了分子技術(shù)在植物分類中的重要作用?？傊瑥木垲悎D可見(jiàn)，雙江古茶樹與采自永德的茶樹親緣關(guān)系最近，而與采自勐海的大葉種樣本和鳳慶的樣本的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

3 討 論

圖3 17份茶樹種質(zhì)的UPGMA聚類Fig.3 UPGMA-based analysis among 17 Yunnan big-leaf tea resources

本研究中12條ISSR引物被用于雙江古茶樹與云南大葉群體品種間的親緣關(guān)系分析，研究結(jié)果表明，16份云南大葉種茶樹及1份“紅毛茶”資源種質(zhì)間DNA擴(kuò)增譜帶的多樣性程度高達(dá)100%，這與劉本英[7]、邵婉芳[9]和段紅星[10]研究云南茶樹種質(zhì)有相似結(jié)果。從聚類樹狀圖可以看出供試種質(zhì)分為2個(gè)大類，第1大類為“紅毛茶”，第2大類又可分成2個(gè)組，組Ⅰ包括雙江古茶樹和永德大葉種，而組Ⅱ包括勐庫(kù)群體品種“勐庫(kù)”、采集自勐海大葉種和鳳慶大葉種。從聚類圖可見(jiàn)，雙江古茶樹與采自永德的茶樹親緣關(guān)系最近，而與采自勐海和鳳慶的大葉種樣本的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。值得一提的是，“紅毛茶”與雙江古茶樹聚類較遠(yuǎn)，這在分子水平為“紅毛茶”與雙江古茶樹之間較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系提供了證據(jù)。

聚類分析也表明，來(lái)自鳳慶和勐庫(kù)的樣本沒(méi)有與地域相對(duì)較近的永德樣本聚在一起，而與地域相對(duì)較遠(yuǎn)的勐海樣本聚在一起，這主要可能因?yàn)椴铇涫歉叨入s合體，且為異花授粉植物，在長(zhǎng)期雜交演化的過(guò)程中產(chǎn)生了大量的不連續(xù)變異，而且長(zhǎng)時(shí)間移種后新環(huán)境對(duì)種質(zhì)的遺傳信息也可能發(fā)生一定影響。也不排除所采樣本屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中勐海、鳳慶、勐庫(kù)三地引種栽培大葉種茶樹的因素。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)ISSR技術(shù)進(jìn)行聚類分析的結(jié)果與通過(guò)葉片大小、葉脈數(shù)等傳統(tǒng)植物學(xué)分類的結(jié)果不完全相同，暗示著分子生物學(xué)與茶樹表觀特征的結(jié)合更利于茶樹分類的真實(shí)性和科學(xué)性。

致謝：本次實(shí)驗(yàn)的部分樣品由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院熊能和李雙榮同學(xué)采集，在此表示感謝！

[1] 陳兆波.分子標(biāo)記的種類及其在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2009, 9(11)： 2179-2181.

[2] 廉 勇, 陳源閩, 王 勇, 等.DNA分子標(biāo)記技術(shù)輔助蔬菜育種研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技, 2008, 5, 78-79.

[3] Prevost A, Wilkinson M J.A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars [J].Theor Appl Genet, 1999, 98： 107-112.

[4] Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D.Genome fingerprinting by Simple Sequence Repeat (Ssr)-anchored polymerase chainreaction amplification [J].Genomics, 1994, 20：176-183.

[5] 劉本英, 王平盛, 周紅杰, 等.云南茶組植物ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006： 21 -25.

[6] 姚明哲, 陳 亮, 王新超, 等.我國(guó)茶樹無(wú)性系品種遺傳多樣性和親緣關(guān)系的ISSR分析[J].作物學(xué)報(bào), 2007, 33(4)： 598-604.

[7] 劉本英, 王麗鴛, 周 健, 等.云南大葉種茶樹種質(zhì)資源ISSR指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2008, 9(4)： 458-464.

[8] 華仁杏3個(gè)雜交組合F1子代遺傳變異的ISSR分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31（10）：100-104.

[9] 邵婉芳, 龐瑞華, 王平盛, 等.云南茶樹種質(zhì)的RAPD研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2003, 36(12)： 1582-1587.

[10] 段紅星, 邵婉芳, 王平盛, 等.云南特有茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 19(3)： 246-254.

ISSR analysis between Shuangjiang ancient tea trees and Yunnan big-leaf tea trees

WU Tian1, SHENG Xiao-jin2, LI Fa-ying3, WEI Ling-chang4, LAN Zeng-quan3
(1.College of Horticulture and Gardening, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunan, China;2.Biotechnology Research Institute, Kunming Academy of Agriculture Science, Kunming 650034, Yunan, China;3.Lincang Tea Research Institute, Lincang 677000, Yunan, China;4.College of Environment Science and Engineering, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunan, China)

ISSR molecular markers were used to analyze the genetic polymorphism of 17 Yunnan big-leaf tea resources.The results show that 193 bands were amplified with 12 ISSR primers, and the polymorphic rate were 100.00 %.The genetic similarity of the materials varied between 0.50 and 0.88.The 17 materials were classified into 2 groups with UPGMA method, and the first group involed “Hongmao Tea”, and the second one included two subgroups.The subgroup Ⅰ included the Shuangjiang ancient tea trees and Yongde big-leaf, and the subgroup Ⅱ included “Mengku”, the Menghai big-leaf and parts of Fengqing big-leaf.The genetic relationship of the ancient tea trees from Shuangjiang and parts of Fengqing big-leaf tea was the closest, and that was more far relatively with Menghai big-leaf tea.

big-leaf tea; germplasm resources; ISSR marker

S794.9；S571.1

A

1673-923X(2012)03-0136-05

2011-12-30

國(guó)家林業(yè)局948項(xiàng)目(2011-4-45)；西南林業(yè)大學(xué)重點(diǎn)基金(110908)和西南林業(yè)大學(xué)“大型儀器設(shè)備共享基金”

吳 田(1980—)，女，山東青島人，副教授，博士，主要從事植物生物技術(shù)及分子生物學(xué)方面的研究；E-mail：461257271@qq.com

藍(lán)增全(1963—)，男，廣東梅縣人，教授，主要從事生態(tài)學(xué)和茶學(xué)方向研究；E-mail： 2351417655@qq.com

[本文編校：歐陽(yáng)欽]