趙 鵬 ，Keith E.Woeste，張存旭 ，程 飛 ，張碩新，蔡 靖

美國和日本核桃RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

趙 鵬1,2,3，Keith E.Woeste2，張存旭1，程 飛1，張碩新1,4，蔡 靖1,4

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊凌 712100 ；2.美國普渡大學(xué) 森林與自然資源系，美國農(nóng)業(yè)部闊葉樹種改良與更新中心， 西拉法葉市 印第安納州 47907，美國；3.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西部資源生物與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069；4.陜西秦嶺森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站，陜西 寧陜 711600）

核桃屬種質(zhì)資源豐富，其中多數(shù)物種木材材質(zhì)優(yōu)良，果實(shí)可食，營養(yǎng)豐富，為重要的經(jīng)濟(jì)樹種。以美國白核桃Juglans cinerea、日本核桃Juglans ailantifolia等為材料，通過改良CTAB方法，從嫩芽、新鮮葉片和干葉片中分別提取核桃基因組DNA，并以此DNA為模板對RAPD-PCR反應(yīng)體系中的一些重要參數(shù)進(jìn)行摸索和優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果表明，改良的CTAB法可有效去除細(xì)胞內(nèi)多糖和多酚等雜質(zhì)對模板DNA的污染， 大大提高DNA的數(shù)量和質(zhì)量。優(yōu)化適合于美國核桃、日本核桃和雜合核桃的RAPD-PCR反應(yīng)體系為：在20 μL的PCR反應(yīng)體系中, 含10 ng 模板DNA, 0.1 mg/mL 牛血清蛋白（BSA）, 0.25 mmol/L dNTPs, 3.5 mmol/L Mg2+，1 μL 10×Taq DNA 聚合酶反應(yīng)緩沖液, 0.5 U Taq聚合酶, 5.0 mmol/L RAPD引物。RAPD-PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋?2℃變性 3 min；93℃ 變性 1 min，35℃ 復(fù)性1 min，72℃延伸 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min，置4℃ 保存。

美國白核桃；日本核桃；RAPD；優(yōu)化

核桃屬Juglans 是胡桃科Juglandaceae 的一個(gè)進(jìn)化屬[1], 該屬成員多為重要的經(jīng)濟(jì)林樹種, 不僅能生產(chǎn)營養(yǎng)價(jià)值高的食用核桃果仁，而且木材材質(zhì)好、生長快[2]。核桃屬植物在全球的栽培歷史久遠(yuǎn)，種質(zhì)資源極為豐富，約有21個(gè)種[3]，是一個(gè)非常重要的用材和堅(jiān)果經(jīng)濟(jì)樹種之一[4]。美國白核桃J.cinerea，也叫白核桃、灰核桃、油核桃或檸檬核桃，是一種短期生長、耐寒、速生的用材和經(jīng)濟(jì)樹種[2-3,5], 可以生產(chǎn)優(yōu)良木材，果實(shí)可以食用并可榨油。20世紀(jì)70年代，該樹種受到一種外來病菌Sirococcus clavigignenti-juglandacearum 的危害，已瀕臨滅絕[3]。日本核桃J.ailantifolia，又稱為心核桃，源產(chǎn)于日本和庫頁島[6],1870 年被引入美國[7-8]。美國黑核桃 J.nigra 通常也稱為東方黑核桃或者美國核桃，為經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的用材樹種[9]，在我國栽培十分廣泛。我國核桃屬植物栽培歷史也十分悠久，在長期進(jìn)化與栽培過程中，表現(xiàn)出了一些特有的優(yōu)良性狀，如孤雌生殖、早實(shí)[10]、豐產(chǎn)和抗性強(qiáng)等。目前，我國主要栽培的核桃品種有以下6個(gè)種：分別是核桃J.regia、鐵核桃J.sigillata、美國黑核桃J.nigra、麻核桃J.hopeiensis、胡桃楸J.mandshurica和野核桃J.catheayensis[1,11-12]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，20世紀(jì)90年代后DNA分子標(biāo)記開始廣泛應(yīng)用于植物分子遺傳育種、分子進(jìn)化等研究領(lǐng)域。DNA分子標(biāo)記是DNA分子水平上遺傳多態(tài)性的直接反應(yīng)，表現(xiàn)為核苷酸的差異[13-14]。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 分子標(biāo)記 (Randomly Amplified Polymorphic DNA) ，簡稱RAPD，常常呈共顯性遺傳[13]。應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行物種品種鑒定，方法簡單、快捷、可靠，不需要任何前期DNA模板信息[4,13,16]。國內(nèi)外也曾報(bào)道有RAPD技術(shù)在核桃屬植物核桃的研究和應(yīng)用[10,15-16]。但是針對美國白核桃、美國黑核桃、日本核桃和雜種核桃的RAPD-PCR反應(yīng)體系報(bào)道較少。DNA的提取和RAPD-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，是對核桃屬植物進(jìn)行遺傳育種等分子生物學(xué)研究必須首先解決的關(guān)鍵問題之一。 本研究的目的：（1）以美國白核桃、美國黑核桃、日本核桃和雜種核桃為試驗(yàn)材料，研究優(yōu)化從葉片中提取基因組總DNA的方法和步驟。（2）進(jìn)一步研究以上幾個(gè)核桃屬植物RAPD反應(yīng)體系中各種組分的濃度、PCR反應(yīng)的溫度和反應(yīng)程序等對PAPD-PCR擴(kuò)增的影響效果，找出適合以上幾個(gè)樹種的RAPD-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化方案，從而為核桃屬植物在分子水平開展的相關(guān)研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

美國白核桃和雜種核桃試驗(yàn)樣品來源于美國不同州和地區(qū)的馬特爾（Martell）核桃遺傳育種試驗(yàn)地；日本核桃采集于美國加州國家種質(zhì)資源中心；美國黑核桃樣品采集于印第安納州巴特勒維爾（見表 1）。4月份從健康植株上采集嫩芽，5月份從健康植株上采集當(dāng)年生新鮮嫩葉2～3片（單株），放入標(biāo)記好的塑料袋中，用保溫箱迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于4℃ 冰箱中，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取與分離方法

DNA的提取與分離參照Doyle and Doyle等人提出的CTAB法[17]，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良。稱取約100 mg新鮮葉片，去除葉脈 （或者采用干葉片），放入2 mL screw-cap試管中，并加入2粒0.5 cm 大小的硬珠豆（Bio 101-Savant, Carlsbad, CA,USA），再加入 1 mL CTAB 提取緩沖液[18]。緩沖液包括 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 50 mmol/L TrisCl, 20 mmol/L EDTA, pH值8.0, 1.4 mol/L NaCl, 0.4 mol/LLiCl, 2% PVP(polyvinylpyrrolidone), 2% SDS。 然 后 用 快 速離心機(jī)研磨，研磨之前迅速加入β-疏基乙醇（β-Mercaptoethanol，2%）。將樣品在研磨機(jī)（Fast Prep 120，Bio 101-Savant, Carlsbad, CA） 轉(zhuǎn)速為55的速度下混勻，40 s 3次，每次間隔期間將樣品放到冰上冷卻3 min。研磨之后，將樣品放到65 ℃ 的雜交爐中勻速旋轉(zhuǎn)，過夜后取出樣品，加入400 μL氯仿并輕輕混勻，室溫13 000 r/min離心5 min。取上清液置1.5 mL離心管中，加入450 μL 混合液（V苯酚∶ V氯仿∶ V異戊醇=25∶ 24∶ 1）后輕輕混勻，室溫13 000 r/min 離心10 min。取上清液置1.5 mL離心管中，加入400 μL氯仿并輕輕混勻，室溫13000 r/min離心5 min（重復(fù)2次）。再取上清液置1.5 mL離心管中，加入 90 %的冷卻異丙醇（4 ℃）和 10 % 的醋酸鈉（3 mol/L NaAc, pH 6.8）并輕輕混勻，室溫19 000 r/min 離心15 min。去上清夜，加750 μL的70 % 乙醇洗2～3次，輕輕將乙醇液體倒掉，注意保留離心試管底部的白色結(jié)晶狀物質(zhì)，室溫干燥后溶于TE 緩沖液（10 mmol/L of Tris, 1.0 mmol/L of EDTA, pH值 8.0）中, 在37℃水浴鍋中放置40 min, 然后置于4℃冰箱保存。

表 1 核桃樣品與種質(zhì)資源信息Table 1 Sample information and the sources of germplasm for this study

1.2.2 DNA檢測方法

分別采用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度。TE緩沖液作為空白對照，用 NanoDrop-8000分 光 光 度 計(jì) （Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE 19810, USA） 檢測DNA質(zhì)量和濃度。用含有5 mg/mL溴化乙錠的1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。DNA在稀釋至所需要的濃度后，保存于-20℃冰箱，初始濃度的基因組DNA置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物的檢測

PCR擴(kuò)增引物為40個(gè)RAPD序列引物由Gene link 公司合成 （見表2）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)以Williams等[12]和Woeste等[14]的反應(yīng)體系為基礎(chǔ)。Taq DNA 聚合酶反應(yīng)緩沖液 [100 mmol/L Tris-HCl, pH 值8.8, 15 mmol/L MgCl2, 500 mmol/L KCl and 0.01% （w/v）gelatin] 購于 Stratagene 公司（La Jolla, California, USA）, Taq DNA聚合酶、dNTPs和牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin , BSA） 購于Promega 公 司（Madison ,Wisconsin, USA）。PCR 反應(yīng)體系 20 μL，其中 dNTPs 0.2 mmol/L，BSA 0.5 mg/mL，TaqDNA聚合酶0.3 U，引物濃度為 0.8 μmol/L, Mg2+濃度為 1.5 mmol/L, DNA 模板質(zhì)量濃度為5 ng/L。當(dāng)一種反應(yīng)成分進(jìn)行濃度（用量）梯度變化實(shí)驗(yàn)時(shí)，其它反應(yīng)成分濃度或者用量不變，通過比較不同處理對RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)成分的處理因素和水平設(shè)計(jì)見表 3。 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性5 min；93℃變性 30 s，35℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸 10 min，置 4℃ 保存。

每個(gè) PCR 產(chǎn)物 （10 μL） 與 0.5 μL 上樣液 染 料 （40 % w/v sucrose, 15 % ddH2O和 30 %glycerol）混合上樣，采用1×TAE緩沖液制成2.0%的凝膠瓊脂糖電泳膠，加熒光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium Bromide, EB）染色到電泳膠中，然后設(shè)置90 W 恒功率電泳，約1.5 h，溴酚藍(lán)指示劑跑至接近膠底部時(shí)，終止電泳。用凝膠成像儀（75312 Bad Wildbad, Germany）檢測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，DNA 片段大小標(biāo)準(zhǔn)用100 bp ladder(Madison,Wisconsin, USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取核桃基因組DNA的改良CTAB方法

實(shí)驗(yàn)（見圖1）表明，采用改良后的CTAB方法均適合于從老葉、新葉、干葉和嫩芽中獲得高濃度和純度的DNA，有效地降低多糖和酚類物對DNA的污染。改良后的CTAB法，從核桃新鮮葉片中所得到的DNA樣品濃度高，平均為763.4 ng/μL，是大部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果DNA提取濃度50 ng/μL的15倍左右；從干葉片中提取出來的DNA濃度平均為196.84 ng/μL，從嫩芽得到的DNA平均濃度為 2 980.4 ng/μL，分別是普通鮮葉片和干葉片的3.9倍和15.1倍。分別從新鮮葉片、干葉片和嫩芽中獲得的高質(zhì)量DNA均可以進(jìn)一步用于分子生物和分子遺傳學(xué)等方面的實(shí)驗(yàn)操作。DNA測定的A260/A280值平均為2.10，A260/A230值平均為2.04，符合基因組DNA的最佳范圍值，說明改良后的CTAB法可應(yīng)用于從核桃屬植物新鮮葉片和干葉片中提取高質(zhì)量和純度的DNA。試驗(yàn)中，采用改良CTAB法，得到的DNA沉淀呈乳白色結(jié)晶狀，加TE緩沖液易溶解，1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測時(shí)，點(diǎn)樣孔無帶，且主帶非常明顯 （見圖 1）。

表 2 40個(gè)隨機(jī)多態(tài)性DNA引物序列Table 2 Sequence of forty RAPD primers used in this study

表 3 RAPD-PCR 反應(yīng)體系的處理因素和水平設(shè)置Table 3 The design factor and level of RAPD-PCR reaction system

圖1 改良CTAB法提取總DNA的電泳檢測結(jié)果Fig.1 Agarose gel results of genomic DNA products using improved CTAB method

2.2 RAPD-PCR反應(yīng)體系

2.2.1 Mg2+和TaqDNA聚合酶濃度的影響

當(dāng)Mg2+濃度為1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L，TaqDNA聚合酶濃度為4個(gè)設(shè)置的用量時(shí)，均產(chǎn)生少量DNA條帶，PCR擴(kuò)增效果不佳。從擴(kuò)增結(jié)果可知，當(dāng)Mg2+濃度梯度為3.5 mmol/L時(shí)，TaqDNA聚合酶濃度為0.5 U 組合時(shí)擴(kuò)增DNA特異條帶最為清晰，擴(kuò)增多態(tài)性強(qiáng)且效果最好（見圖 2）。

圖2 不同Mg2+和TaqDNA聚合酶濃度條件下RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Fig.2 Results of RAPD-PCR products using different Mg2+ concentration and different amount of Taq DNA polymerases

2.2.2 模板DNA和引物濃度的影響

引物濃度對RAPD-PCR擴(kuò)增影響較大，引物濃度在1.0 mmol/L和2.0 mmol/L時(shí)沒有任何PCR產(chǎn)物。模板DNA濃度對PCR擴(kuò)增效果影響不大，對幾個(gè)不同種的核桃和雜種核桃樣品擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果為，DNA模板濃度為 10 ng/μL和引物濃度為5.0 mmol/L組合時(shí)得到的RPAD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物效果最好。

2.2.3 BSA和dNTPs濃度的影響

結(jié)果表明，BSA濃度梯度對RAPD-PCR擴(kuò)增影響并不顯著。當(dāng)BSA 濃度為0.10 mg/mL時(shí)，DNA特異條帶最為清晰。在此基礎(chǔ)上，dNTPs濃度為0.25 mmol/L時(shí)得到的PCR產(chǎn)物效果非常好。

2.2.4 反應(yīng)擴(kuò)增程序的影響

研究發(fā)現(xiàn)，2個(gè)RAPD引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)退火溫度為35℃效果最好。對變性溫度和時(shí)間篩選結(jié)果表明，在 93℃下1 min效果最為理想；退火時(shí)間和延伸時(shí)間也均為60 s時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果最好。熱循環(huán)次數(shù)分別設(shè)置了30、32、35和38。結(jié)果表明，在35個(gè)循環(huán)下，擴(kuò)增的條帶多態(tài)性最好，如果降低循環(huán)次數(shù)，擴(kuò)增條帶多態(tài)性會降低。

經(jīng)過對RAPD-PCR優(yōu)化后，采用美國白核桃、美國黑核桃、日本核桃和雜種核桃的DNA樣品分別進(jìn)行了試驗(yàn)，均可以到很好的PCR擴(kuò)增效果（見圖 3）。

3 討 論

3.1 基因組總DNA提取方法

DNA的提取是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)，近些年來一些新的或者改良的DNA提取純化方法不斷出現(xiàn)[19-20]。不同植物DNA提取方法往往有差異，特別是富含多糖及多酚類物質(zhì)的果樹葉片中提取DNA方法難度大于禾谷類及蔬菜類植物[21-22]。從核桃屬植物葉片中用CATB法提取基因組總DNA主要有以下幾個(gè)方面的改良和優(yōu)點(diǎn)：一是，加入2粒硬珠豆在試管中，在快速離心機(jī)的研磨后，放到雜交爐中，設(shè)置65 ℃勻速搖晃過夜，使得細(xì)胞充分破裂，有利于提純。二是，加入更多的SDS（2 %）能使裂解細(xì)胞變易,使染色體離析，蛋白變性，同時(shí)SDS與蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合成復(fù)合物,釋放出核酸。這樣就可以很好地裂解細(xì)胞，去除較多的糖類雜質(zhì)。三是，適當(dāng)加大β-巰基乙醇劑用量，能防止多酚污染。同時(shí)，用苯酚、氯仿、異戊醇的混合液（v/v，25∶24∶1）提純步驟，可以提高DNA質(zhì)量，因?yàn)楫愇齑伎梢詼p少提取震蕩過程中的氣泡產(chǎn)生。四是，提取的每個(gè)步驟過程中，可加入50～100 μL的TE緩沖液，可以大大增加上清液的量，并且可以得到更多的DNA，獲得的DNA純度高、數(shù)量多，并能夠滿足各種分子生物學(xué)試驗(yàn)要求。CTAB法經(jīng)過改良之后，操作簡單，不需要太多的儀器。缺點(diǎn)是操作步驟相對繁瑣。利用核桃的鮮葉片和干葉片對改良后的CTAB法進(jìn)行了檢測，提取DNA純度和質(zhì)量都很高。在CTAB中加入2 %的PVP可以有效去除多糖，并可與多酚結(jié)合形成復(fù)合物，從而有效避免多酚類化合物介導(dǎo)的DNA降解[19,23-24]。

3.2 RAPD-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

在不同植物中， RAPD-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化試驗(yàn)報(bào)道很多，研究者大都認(rèn)為RAPD技術(shù)很大程度上有著不穩(wěn)定性，重現(xiàn)率低的缺點(diǎn)。Mathews等[25]證明RAPD可在草莓上多次重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；吳燕民等[11]也通過相同的RAPD產(chǎn)物重復(fù)的結(jié)果證明鐵核桃為核桃屬中一個(gè)獨(dú)立種。經(jīng)過本試驗(yàn)結(jié)果表明，用相同的試劑和藥品，在相同的反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)條件下，RAPD-PCR分析還是具有很高的重復(fù)性，這與王正加等[25]報(bào)道胡桃科山核桃的研究結(jié)果一致。

TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，Mg2+濃度過高會抑制Taq酶的活性，過低對Taq酶的活化不夠，影響擴(kuò)增效果。本試驗(yàn)對美國白核桃、美國黑核桃、日本核桃及雜種核桃RAPD-PCR反應(yīng)中Taq酶的用量為0.5 U，Mg2+最佳濃度為3.5 mmol/L。Mg2+濃度與其他研究結(jié)果Mg2+濃度為2.5～3.5 mmol/L接近[4,9-10]，同時(shí)，大部分研究結(jié)果Taq酶的用量為0.4～1.0 U，而張美勇等[4]RAPD研究中Taq酶的用量為0.03 U，這可能與Taq酶的成分有關(guān)。經(jīng)試驗(yàn)表明，引物濃度的高低會對RAPD擴(kuò)增效果影響很大。引物濃度過高，會使非特異性譜帶增加；反之，則導(dǎo)致擴(kuò)增譜帶明顯減少。在核桃PCR反應(yīng)體系的研究中，RAPD引物濃度的差異較大[4,16]，本試驗(yàn)中對日本核桃、美國核桃和雜種核桃的RAPD引物濃度為5.0 mmol/L，PCR擴(kuò)增效果佳，與Nicese等[26]的研究結(jié)果4.0 mmol/L接近。 DNA模板濃度和純度對RAPD-PCR反應(yīng)結(jié)果也有一定影響，DNA模板濃度一般大于10 ng, 而楊克強(qiáng)等[16]RAPD-PCR反應(yīng)中用150 ng模板DNA也能獲得較好的擴(kuò)增結(jié)果。BSA 可以封閉乙酰對RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的抑制作用[28]，用于PCR可改善擴(kuò)增結(jié)果的特異性與酶的穩(wěn)定性，增加PCR產(chǎn)量及產(chǎn)物[29-30]。大部分研究的試驗(yàn)材料在RAPD-PCR反應(yīng)體系中都沒有加入BSA增效劑，但在本實(shí)驗(yàn)中，加入BSA后，RAPD-PCR擴(kuò)增效果明顯比不加要好，產(chǎn)物條帶清晰，且量多。

3.3 RAPD-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

預(yù)變性是指DNA在溫度升到一定程度時(shí)雙鏈打開，形成單鏈的過程。合適的預(yù)變性時(shí)間是PCR擴(kuò)增成功的必要條件。本研究中，對幾個(gè)核桃物種的預(yù)變性溫度和時(shí)間分別是92 ℃，3 min。在其他核桃屬植物研究中，山核桃為94 ℃，2～5 min[26]；核桃為 95℃，5 min[4]、94℃，5 min[10]。大量研究結(jié)果表明，復(fù)性時(shí)間為1 min，張美勇等[4]80 s，Woeste等[31]30 s；延伸時(shí)間多為2 min，本試驗(yàn)中1 min延伸時(shí)間為最佳。退火溫度是引物與模板DNA結(jié)合的關(guān)鍵。溫度太高，背景雖然清晰，但條帶數(shù)量明顯減少；溫度太低，非特異性譜帶明顯增加，甚至背景發(fā)亮。退火溫度根據(jù)不同的RAPD引物可以適當(dāng)調(diào)整，一般為35 ℃或者36 ℃為最佳。山核桃的最佳退火溫度為38 ℃，30 s[26]。RPAP-PCR反應(yīng)的程序多為40個(gè)循環(huán)以上，山核桃為38個(gè)循環(huán)[26]，核桃為43、45、45個(gè)循環(huán)[4,11,32]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，RAPD-PCR反應(yīng)程序?yàn)?5個(gè)循環(huán)下可以得到理想的擴(kuò)增效果，這樣可以節(jié)約時(shí)間。

致謝 ：感謝Marcia Kremer，Charles Michler，Lisa Worthen，Janis Gosewehr，Hannah Bergeman，黃忠蓮 (Julie) 對本實(shí)驗(yàn)研究的技術(shù)支持，James McKenna對試驗(yàn)材料的采集。

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Optimization of RAPD-PCR reaction system for American and Japanese walnut

ZHAO Peng1,2,3, WOESTE E.Keith2, ZHANG Cun-xu1, CHENG Fei1, ZHANG Shuo-xin1,4, CAI Jing1
(1.College of Forestry, Northwest Agriculture & Forestry University, Yangling 712100, Shaanxi, China; 2.USDA Forest Service Hardwood Tree Improvement and Regeneration Center, Dept.of Forestry and Natural Resources, Purdue University, West Lafayette,IN 47907, USA; 3.Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, College of Life Science, Northwest University, Xi’an 710069, Shannxi, China; 4.Qinling National Forest Ecosystem Research Station, Ningshan 711600, Shaanxi, China)

Germplasm resources for the genus Juglans (Juglandaceae) are rich, and the genus contains many tree species, commonly called walnuts, that are valued for their high quality timber and nuts.The CTAB method was improved to extract genomic DNA from walnut buds, fresh and dried leaves.Using the obtained DNA as templates, the important parameters influencing the application of RAPD-PCR for walnut species were optimized.The results indicate that the modified CTAB method more effectively removed most of the polysaccharides in the cytoplasm and inhibited the formation of oxidized polyphenolic compounds, compared with the traditional CTAB method.The optimal RAPD-PCR reaction conditions for Juglans cinerea , Juglans ailantifolia , J.nigra, and species hybrids included, in a total volume 20 μL, 1μL of 10 ng/μL DNA, 2 μL of 10×Taq DNA polymerase reaction buffer (1.5 mmol/L Mg2+),2.5 μL of 200 mmol/L dNTPs (0.25 mmol/L), 2 μL of 1mg/mL BSA (bovine serum albumin, 0.1 mg/mL), 2 μL of 25 mmol MgCl2(2.5 mmol), 4 μL of 50 mmol RAPD decamer primer pair, 0.5 units Taq polymerase, and 5.0 μL sterilized distilled water.Thermal cycling conditions were as follows： denaturation 3 min at 92℃ ; 35 cycles of 1 min at 92℃ , 1 min at 35℃ , 2 min at 72℃ ; and a final extension of 10 min at 72℃ at the end of the amplification.

butternut；heartnut；RAPD；optimization

2011-10-21

國家“十二五”科技支撐計(jì)劃課題“高效可持續(xù)農(nóng)林復(fù)合系統(tǒng)構(gòu)建及調(diào)控技術(shù)研究”（2011BAD38B0202）；西北大學(xué)科研啟動(dòng)基金（PR11055）；美國印第安納州自然保護(hù)局核桃遺傳與保護(hù)研究項(xiàng)目（#2041-0006）

趙 鵬（1980- ），男，陜西榆林人，講師，博士，主要從事植物分子進(jìn)化和分子生態(tài)學(xué)研究

蔡 靖（1968- ），女，陜西子洲人，副教授，博士，研究方向：植物生理生態(tài)和森林生態(tài)；E-mail：cjcaijing@163.com

S792.13

A

1673-923X(2012)03-0129-07

[本文編校：謝榮秀]