武海霞，劉麗婷,2，廖柏勇，莫曉勇

20種桉樹及雜交種的花粉形態(tài)分析及分類學意義

武海霞1，劉麗婷1,2，廖柏勇1，莫曉勇1

(1.華南農業(yè)大學 林學院,廣東 廣州 510642; 2.江西省林業(yè)科學院,江西 南昌 330032）

以20個桉樹樹種和雜交子代的花粉為研究對象，通過掃描電鏡分析花粉顯微結構特征。結果表明：（1）桉樹花粉微觀形態(tài)具有高度一致性，都屬于小孢粉（10～25 μm）。極面觀為鈍三角形，赤道面觀為橢圓形，屬于三環(huán)孔溝類型。萌發(fā)溝細長，溝緣不整齊，直達兩極匯合形成合溝或者副合溝，溝膜多為顆粒狀紋飾?；ǚ弁獗诠饣蛘呔哂屑y飾。（2）桉樹不同樹種在花粉粒的大小、萌發(fā)器官及外壁紋飾的細微特征上均表現出明顯差異，可作為桉樹種間鑒別的重要手段。（3）花粉微觀形態(tài)可作為分析親本與雜交子代關系的指標之一，為雜交品種的鑒定與表現型預測提供科學依據。

桉樹; 花粉; 顯微結構; 分類

桉樹Eucalyptus屬桃金娘科Myrtaceaae，包含杯果木屬Angophora Cav.、傘房屬Corymbia K.D.Hill & L.A.S.Johnson和 桉 屬Eucalyptus L’Hert[1]。根據目前公認的Hill & Johnson 分類系統(tǒng)[2]，桉樹可以分為808個種和137個亞種，共945個種及亞種[3-4]。但因桉樹被引種到自然分布區(qū)以外時，為了適應新的生態(tài)地理環(huán)境條件，表型形態(tài)特征會發(fā)生較大的變化。且伴隨雜交、自交、回交等多重方式，因此直接通過表型性狀分析進行桉樹分類是有待考證的[5]。

花粉是植物系統(tǒng)發(fā)育過程中較保守的器官，不易受外部自然環(huán)境的影響，因此花粉形態(tài)具有較強的遺傳保守性，即具有固定的形狀、大小、表面紋飾和萌發(fā)器官特征[6-8]?；ǚ哿５男螤?、大小、外壁的形態(tài)結構具有種屬特異性，花粉的變異程度往往標志著該類群的進化水平，因而被廣泛用于屬、種、品種間親緣關系分析[9]?；ǚ畚⒂^形態(tài)分析操作簡單，結果可靠性高，故被很多植物學家及分類學家采用[10]。目前，花粉形態(tài)特征分類與傳統(tǒng)的形態(tài)特征分類結果的一致性得到植物學家的認可[11-12]，中國已有63.64%的裸子植物、36.36%的雙子葉植物以及33.33%的單子葉植物進行了花粉形態(tài)的系統(tǒng)研究，涉及觀賞植物、果樹、林木、中草藥等[13]。在研究植物分類時多被引用為重要依據[14]。

目前有關桉樹多樣性的研究都是從形態(tài)學及分子生物學角度來進行的，尚未有從花粉學的角度進行桉樹形態(tài)演化規(guī)律方面的研究。關于桉屬花粉微觀形態(tài)研究僅有少量報道。Pike在1955年研究了桃金娘科71屬300種的花粉[15]。中科院孢粉組觀察了桃金娘科11屬的15種花粉，桉屬只有二色桉、赤桉、岡尼桉、纖脈桉等少數幾個樹種的花粉微觀形態(tài)被簡單報道過，沒有深入地比較分析。目前為止，在中國廣泛引種和推廣種植的雙蒴蓋亞屬橫脈組和窿緣組樹種的花粉微觀形態(tài)研究尚未見公開報道[16]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗以華南地區(qū)廣泛種植的粗皮桉E.pellita、尾葉桉E.urophylla、韋塔桉E wetarensis、細葉桉E.tereticornis及雜交種，共20種成熟花粉為研究對象，實驗花粉的采集地點及時間見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 掃描電鏡觀察法

新鮮花粉經FAA固定液固定24 h，進行50%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換后經CO2臨界點干燥。在解剖鏡下將干燥后的花粉均勻地粘在樣品臺上，真空噴金鍍膜后用SEM觀察。

每個品種至少選取30?；ǚ邸y量正?；ǚ哿O軸長P、赤道軸長E、萌發(fā)溝長L、溝寬W、溝深D、萌發(fā)孔長A、萌發(fā)孔寬B；計算極赤比P/E、體積大小指數、極溝比L/P以及合溝區(qū)與花粉邊長之比T、面積之比S，共12個定量指標；觀察花粉的赤道面觀、極面觀形狀、萌發(fā)器官和外壁紋飾特征[17]；選取有代表性的群體、赤道面、極面進行拍照。為一致起見，花粉的赤道軸長只在萌發(fā)孔的中心正好對著或者背離觀察者的眼睛時才測量。

1.2.2 分析方法

采用等級數量編碼方法進行性狀編碼，二元性狀編號為0，1，定性多態(tài)性狀按不同形態(tài)進行編號為1，2，…，n。數值性狀取平均值直接進入下一步數學運算。計算時將各運算單位數值直接輸入計算機中，利用SAS分析軟件進行主成分分析，然后應用GenStat統(tǒng)計軟件進行最小距離聚類分析[18]。

2 結果與分析

2.1 樣品花粉的形態(tài)分析

對20個桉樹樹種及雜交子代的花粉掃描進行分析表明，多數桉樹花粉呈黃色或者淡黃色，是輻射對稱的扁球形單粒花粉（極赤比介于4∶8～6∶8之間）。根據Erdtman分級標準（以花粉最長軸的長度來表示），桉樹花粉屬于小孢粉（10～25 μm）。極面觀為鈍三角形，赤道面觀為橢圓形。按照Erdtman的NPC分類系統(tǒng)（基于萌發(fā)器官的數目、位置和特征的分類系統(tǒng)）進行對照，桉樹花粉應為N3P4C5型，即三環(huán)孔溝類型。萌發(fā)溝細長，溝緣不整齊，直達兩極匯合形成合溝或者副合溝[19]。溝膜多為顆粒狀紋飾；萌發(fā)內孔細長，位于赤道萌發(fā)溝中心，通過附近的外壁膨脹，也就是緣來體現。外壁光滑或者具有紋飾[13]。20個桉樹樹種及雜交子代的花粉在形狀和外壁紋飾等方面的差異詳見表2，掃描電鏡圖片見圖1。

圖1 桉樹花粉掃描電鏡圖Fig.1 SEM photos on pollens of 20 Eucalyptus species and progenies

2.2 樣品花粉的聚類分析

20個桉樹樹種及雜交子代花粉的10個定量指標及4個定性指標見表3。選擇極軸長、赤道軸長、體積大小指數、萌發(fā)孔長、萌發(fā)孔特征、萌發(fā)溝特征、赤道面特征和極面特征8個指標進行最小距離聚類分析，得到譜系聚類圖（見圖2），聚類分析R2值分布見圖3。據圖將所有品系分成8類。粗皮桉單獨成第1類；第2類由TU-1、UT-3、AK共3個雜交子代組成；第3類包含UT-5、UT-7、UT-9、韋塔桉、TU-3、W5、UT-1、UT-6、UT-8、TU-4；尾葉桉和UG-1組成第4類；TU-2、細葉桉、UP-1、UT-2分別自成1類，為第5至第8類。

表3 20個桉樹花粉樣品指標Table 3 Pollens morphological characteristics tested of 20 Eucalyptus species and progenies

圖2 桉樹花粉微觀形態(tài)聚類Fig.2 Clustering analysis of pollens ultra-morphology

圖3 桉樹花粉微觀形態(tài)聚類分析R2值分布Fig.3 R 2 values distrbution of pollens ultra-morphology

在桉樹譜系聚類圖中可以直觀的得到20個樹種及雜交子代之間親緣關系的遠近和分類情況。根據表2的花粉微觀形態(tài)特征描述，以花粉微觀形態(tài)多樣性為契點，可以快速地對上圖中的各類花粉進行分類分析。

(1)粗皮桉、尾葉桉和細葉桉花粉可以很快鑒別出來。粗皮桉花粉是合溝花粉，尾葉桉花粉為副合溝花粉，細葉桉花粉同時具有合溝與副合溝，三者的遺傳距離較遠。除了萌發(fā)溝的形態(tài)之外，萌發(fā)孔的加厚程度、突起程度以及溝間區(qū)的紋飾和花粉粒的大小等也有明顯區(qū)別，如粗皮桉的花粉溝間區(qū)為稀疏的淺穴狀紋飾，萌發(fā)孔突起或者下陷；細葉桉花粉萌發(fā)孔內陷，緣顯著加厚。這些都可以迅速將粗皮桉、尾葉桉和細葉桉花粉分到不同的類中。

(2)UP-1是尾粗桉花粉，同時具有合溝與副合溝，萌發(fā)孔微突起，具光滑的緣，微加厚。溝間區(qū)為腦紋狀紋飾伴隨深穴狀紋飾，溝間極區(qū)或者合溝區(qū)的形狀為凹弧三角形，在極區(qū)萌發(fā)溝的寬度發(fā)生變化。這些與眾不同的形態(tài)特征，使得UP-1與親本的遺傳距離較遠，自成一類。對于雜交后代來說，可以用超親表達來解釋。隨之帶來的生物學或其他方面的變異，還有待進一步研究。

(3)TU-2與UT-2是細尾桉與尾細桉花粉，親本相同但父母本相異。直接影響結果是二者花粉微觀形態(tài)的巨大差異。TU-2花粉萌發(fā)孔突起或者微凸起，具顯著加厚的緣，呈突出的半橢球形，長軸與極軸方向相同。而UT-2的花粉萌發(fā)孔緣加厚不顯著，但其同時出現突出與下陷的萌發(fā)孔。前者具有副合溝。副合溝與萌發(fā)溝的寬度相近。溝間極區(qū)形狀不規(guī)則，表面為腦紋狀紋飾。溝緣組成直三角形，內角約為60°。極區(qū)面積很小，僅占花粉總面積的3.6%。后者同時具有合溝與副合溝，極區(qū)結構更具有復雜多樣性。同時參考其萌發(fā)孔長、極軸長等其他定量定性因子，這2種花粉之間以及它們與其他花粉之間遺傳距離很遠，彼此單獨劃成1類。

以上特點都可以快速地將各花粉區(qū)別開來。當然在聚類分析中也同時計算考慮了花粉體積大小的相關量化指標。

(4)第2類花粉的共同點是萌發(fā)孔突起，具合溝，合溝區(qū)表面光滑或者具有微小顆粒狀紋飾，合溝區(qū)為凹弧三角形，內角小于或者等于60°。TU-1、UT-3和AK的花粉溝間區(qū)紋飾弱化，溝緣附近為穴狀或淺穴狀紋飾。合溝區(qū)具有顆粒狀紋飾，凹弧三角形，弧度較大，三角形內角均小于40°。這一類花粉與粗皮桉的親緣關系較近，與尾葉桉和細葉桉的親緣關系較遠，尤其是細葉桉。且TU-1、UT-3的萌發(fā)孔緣加厚不顯著，AK顯著加厚，故TU-1、UT-3親緣關系最近，其次是AK。

(5)第3類中，UT-5、UT-7、UT-9、韋塔桉、TU-3、W5、UT-1、UT-6、UT-8、TU-4花粉微觀形態(tài)相近，外壁紋飾為腦紋狀紋飾或者淺穴狀紋飾，合溝區(qū)為凹弧三角形或直線三角形，內角在40°～60°之間。根據萌發(fā)孔緣增厚的情況，又可以進一步把溝緣顯著加厚的UT-5與其他花粉區(qū)分開來。UG-1與尾葉桉雖然萌發(fā)孔和赤道面觀特征與前三組接近，但萌發(fā)溝為副合溝，且溝間區(qū)形狀不規(guī)則。

(6)AK為雜交子代，但親本未知。從花粉微觀形態(tài)可以看出，AK與TU-1、UT-3的親緣關系較近，其次是粗皮桉。由此一方面可以推斷，AK是尾葉桉、細葉桉的雜交子代，與TU-1、UT-3形態(tài)相似，與親本的變異較大，屬于超親表達現象。另一方面，也可以推斷其是粗皮桉的雜交子代。

(7)從聚類圖中可以看出，韋塔桉和W5與UT-5、UT-7、UT-9、TU-3、UT-1、UT-6、UT-8、TU-4聚在一起，由此可以推斷韋塔桉和W5與尾葉桉或者細葉桉具有親緣關系。從遺傳距離可以看出，二者與尾葉桉的關系更近一些。這與目前公認的觀點相一致。

3 小結與討論

(1)桉樹的花粉微觀形態(tài)具有一致性，表現為輻射對稱的扁球形單?；ǚ?，極面觀為鈍三角形，赤道面觀為橢圓形，屬于三環(huán)孔溝類型。萌發(fā)溝細長，溝緣不整齊，直達兩極匯合形成合溝或者副合溝。溝膜多為顆粒狀紋飾；萌發(fā)內孔細長，位于赤道萌發(fā)溝中心，通過附近的外壁膨脹，也就是緣來體現。外壁光滑或者具有紋飾。

(2)不同樹種在花粉粒的大小、萌發(fā)器官特征以及外壁紋飾的細微特征上均表現出明顯差異，可作為桉樹種間鑒別的重要依據。通過對20個樹種和雜交子代的花粉進行電鏡形態(tài)觀察，建立桉樹花粉微觀形態(tài)學的量化指標。對桉樹花粉的定量指標和定性指標進行最小距離聚類分析，得到桉樹花粉譜系聚類圖，直觀反映出20個樹種與雜交子代之間親緣關系的遠近和分類情況，與桉樹植株表型分類結果基本一致，但內部也存在一定的差異。

(3)桉樹花粉微觀形態(tài)可作為分析親本與雜交子代關系的指標之一，為雜交品種的鑒定與表現型預測提供科學依據。對16個雜交子代花粉的微觀形態(tài)分析及分類表明，雜交子代與親本的親緣關系越近，遺傳距離越小，可以據此推斷優(yōu)良無性系的親緣關系。但另一方面，個別無性系的花粉形態(tài)與親本的變異較大，屬于超親表達現象。

[1] 普賴爾，王豁然，約翰森.桉樹分類[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學出版社，1986：103-109.

[2] 王豁然.桉樹生物學概論[M].北京：科學出版社，2010：334.

[3] 王豁然，布洛克.中國桉樹檢索表[M].北京：中國科學技術出版社，1991：74.

[4] 王豁然，江澤平,李延峻，等.格局在變化-樹木引種與植物地理[M].北京：中國林業(yè)出版社，2005：277.

[5] 王豁然，鄭勇奇.外來樹種與生態(tài)環(huán)境[M].北京：中國環(huán)境科學出版社，2001：16.

[6] 熊 壯，曹福亮.銀杏花粉研究進展[J].林業(yè)科技開發(fā)，2010，24(4)：6-9.

[7] 張雙雙，奚曉軍.黑楊花粉活力和柱頭可授性研究[J].安徽農業(yè)科學，2010，38(20)：10550-10552.

[8] 姜正旺，王圣梅.獼猴桃屬花粉形態(tài)及其系統(tǒng)學意義[J].植物分類學報，2004，3(3)：245-260.

[9] 劉有春，劉威生，劉 寧，等.基于花粉形態(tài)數量分類的核果類系統(tǒng)關系研究[J].植物遺傳資源學報，2010，11(5)： 645-649.

[10] 中國科學院植物研究所古生物研究室孢粉組譯.孢粉學手冊[M].北京：科學出版社，1978：429.

[11] Zavada M S, Lowrey T K.Comparative pollen morphology of brachylena, tarchananthus and two species of tubulifloridites(asteraceae) from the eocene, Knysna lignite of South Africa[J].Review of palaeobotany and palynology, 2010, 162(2)： 183-192.

[12] 蔡 丹，劉 軍.四川金桂品種群桂花品種的花粉形態(tài)研究[J].江蘇農業(yè)科學，2010，(2)：180-183.

[13] 趙先貴，肖 玲.中國植物花粉形態(tài)的研究進展[J].西北植物學報，1999，19(5)：92-95.

[14] Wang H, Mill R.Pollen morphology and infra-generic evolutionary relationships in some Chinese species of Pedicularis(Scrophulariaceae) [J].Plant systematic and evolution, 2003, 237(1-2)：1-17.

[15] 中國科學院植物研究所形態(tài)室孢粉組.中國植物花粉形態(tài)[M].北京：科學出版社，1960：181-183.

[16] Fan L K, Lu Y M, Yan G J, et al.Classification of Chinese wintersweet (Chimonanthus praecox) cultivars supported by pollen morphology[J].Agricultural sciences in China, 2010, 9(7)：958-964.

[17] 李 奎，王 雁，鄭寶強,等.40個野生滇牡丹群體的花粉形態(tài)研究[J].北京林業(yè)大學學報，2011，33(1)：94-103.

[18] 朱 琨，張 璐，陳雅君,等.37個早熟禾品種的花粉形態(tài)及其分類學意義[J].草地學報，2011,19（1）：114-121.

[19] 宛 濤，孫啟忠，蔡 萍,等.冷蒿正種與其變種的花粉形態(tài)觀察[J].內蒙古農業(yè)大學學報，2011,32(1)：41-44.

[20] Mayer E, Cottsberger G.Pollen viability in the geneus silene(cayrophyllaceae)and its evaluation by means of different test procedures[J].Flora, 2000, 195(8)：349-353.

Pollen morphology and resuting taxonomic implications of 20 Eucalyptus species and progenies

WU Hai-xia1, LIU Li-ting1,2, LIAO Bo-yong1, MO Xiao-yong1
(1.Forestry College, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China;2.Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang 330032, Jiangxi, China)

Morphological and ultra-structure characters of 20 Eucalyptus species and progenies were examed by means of scanning electron microscop.The results indicate that Eucalyptus pollens were microspore(10～ 25 μm）and in a high consistence.Polar view was a obtuse triangle, equatorial view was ellipse，the germinal furrow long and thin, gully edge was not tidiness, then extens two polar together.Colpus membrane had more granular adorning; and the germinature inner hole slender in the middle of germinature furrow.The exine was smooth or had some fuzzy sculpture.The size of Eucalyptus pollen, germinature organ features and the fine-features in exine sculpture showed some significant differences in the different species of Eucalyptus, which could be important indexes of the relationships between the parents and their descendants, and can provide a scientific basis for identificating the species’ and predicting the species’ phenotype.

Eucalyptus; pollens; microscopic morphology; classification

S792.39

A

1673-923X(2012)03-0029-08

2011-12-15

廣東省自然科學基金項目”抗桉樹枝癭姬小蜂基因的標記篩選及連鎖分析”(粵科基字[(2010)03號])

武海霞(1986-),女,山東泰安人,碩士研究生,研究方向：林木遺傳育種; E-mail：skyoflove860821@163.com

莫曉勇(1962-),男,四川達縣人,教授,主要研究方向：森林培育和人工林經營; E-mail：xyscut2006@yahoo.com.cn

[本文編校：謝榮秀]