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        桔梗多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)

        2012-12-27 02:30:22陸金健周文雅施佳杰沃興德
        食品與機(jī)械 2012年3期
        關(guān)鍵詞:桔梗胸腺免疫抑制

        賈 林 陸金健 周文雅 施佳杰 沃興德

        (浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310053)

        桔梗多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)

        賈 林 陸金健 周文雅 施佳杰 沃興德

        (浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310053)

        研究桔梗多糖(PPS80)對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)所致免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。將60只雄性KM小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、桔梗多糖低、中、高劑量治療組(100,200,400mg/(kg·d))和鹽酸左旋咪唑(LMS)陽性組。連續(xù)3d腹腔注射環(huán)磷酰胺80mg/(kg·d)建立免疫抑制小鼠模型,于給藥治療1周后利用稱重法檢測胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),ELISA法測定血清白介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。結(jié)果表明,桔梗多糖能明顯增加環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),顯著提高血清中IL-2和TNF-α的含量并呈劑量依賴性。桔梗多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠具有免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用。

        桔梗;多糖;免疫增強(qiáng);白介素-2;腫瘤壞死因子-α

        中藥桔梗為桔??疲╟ampanulaceae)植物桔梗(Platycodon grandiflorumA.DC)的干燥根,味苦、辛,平,用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞、肺癰吐膿[1],現(xiàn)代研究[2]顯示其具有降血糖、降血脂、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、擴(kuò)張血管、抗氧化等功效。多糖作為桔梗的主要化學(xué)成分之一,文獻(xiàn)[3]報(bào)道其在體外能清除羥基自由基和超氧陰離子自由基,并對(duì)細(xì)胞水平具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[4-6]。筆者[7]曾通過對(duì)桔梗飲片熱水浸提、乙醇分步沉淀、Sevage法脫蛋白提取得到了桔梗多糖PPS80。本試驗(yàn)旨在進(jìn)一步明確PPS80對(duì)環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)所致免疫抑制小鼠的影響,為深入研究和開發(fā)桔梗多糖提供理論依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料與試劑

        桔梗飲片:浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠;

        KM小鼠:雄性清潔級(jí),上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2007——0005;

        氯化鈉注射液:杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司;

        鹽酸左旋咪唑(LMS):日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;

        環(huán)磷酰胺(CTX):中國Sigma公司;

        Mouse IL-2ELISA試劑盒:美國ADL公司;

        Mouse TNF-αELISA試劑盒:美國ADL公司;

        正丁醇、硫酸等:分析純,華東醫(yī)藥股份有限公司。

        1.2 主要儀器

        微量振蕩器:MH-2型,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;

        恒溫金屬?。篊HB-100型,杭州博日科技有限公司;

        電子分析天平:AE240型,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;

        高速冷凍離心機(jī):CR21GⅢ型,日本日立公司;

        多功能酶標(biāo)儀:Spectra Max M3型,美國Dynex公司。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 桔梗多糖的制備 桔梗飲片60℃烘干、搗碎,過60目篩,加10倍量的蒸餾水80℃回流5次,每次2h,合并水提液,過濾,濃縮。先加入95%乙醇使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%,4℃靜置10h后,3 000r/min離心10min,合并上清液;繼續(xù)加入95%乙醇,使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%,4℃靜置10h后,3 000r/min離心10min;按Sevage法脫蛋白,于MD44-3500透析袋中蒸餾水透析48h,濃縮烘干得PPS80[7],苯酚-硫酸法檢測糖含量為85.01%[8]。

        1.3.2 動(dòng)物分組及給藥 60只雄性清潔級(jí)KM小鼠,體重18~22g。先適應(yīng)性飼養(yǎng)3d,然后隨機(jī)分為2組:正常組12只,造模組48只。按文獻(xiàn)[9]制備免疫抑制小鼠模型,即造模組連續(xù)3天腹腔注射CTX 80mg/(kg·d),正常組腹腔注射等體積氯化鈉注射液,于第4天每組各取3只檢測造模效果。造模成功后造模組隨機(jī)分為5組,每組9只:PPS80低、中、高劑量治療組分別腹腔注射100,200,400mg/(kg·d)PPS80溶液,陽性組灌胃80mg/(kg·d)LMS溶液,模型組腹腔注射等體積氯化鈉注射液,連續(xù)給藥1周。正常組每天腹腔注射等體積氯化鈉注射液。所有藥物均以氯化鈉注射液現(xiàn)配現(xiàn)用。

        1.3.3 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定 末次給藥24h后,精確稱重,頸椎脫臼處死小鼠,立即分離出胸腺和脾臟并稱重,以胸腺或脾臟(mg)和體重(g)的比值表示小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)。

        1.3.4 血清IL-2和 TNF-α含量的檢測 末次給藥24h后,摘除眼球取血,1 000×g離心10min取血清,采用雙抗夾心 ABC-ELISA法測定血清IL-2和 TNF-α含量,嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作,即酶標(biāo)包被板分設(shè)為空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測血清樣品孔,空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL,標(biāo)準(zhǔn)孔依次加1 200,600,300,150,75ng/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL,樣品孔先加樣品稀釋液40μL,再加各待測血清10μL,37℃溫育30min,每孔加入200μL以蒸餾水稀釋30倍的濃縮洗滌液洗板,靜置30s后棄去,重復(fù)5次,拍干。除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑50μL,37℃溫育30min,同樣操作洗板5次后拍干,每孔先加入顯色劑A 50μL,再加顯色劑B 50μL,輕震混勻,37℃避光顯色15min,每孔加50μL終止液終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零,于450nm波長處檢測吸光度,根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清IL-2和TNF-α含量。

        1.4 統(tǒng)計(jì)方法

        所有數(shù)據(jù)均采用 Microcal origin 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料采用±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 造模效果評(píng)價(jià)

        造模組連續(xù)3天腹腔注射CTX 80mg/(kg·d)后,隨即各取正常組與造模組3只分離出胸腺和脾臟。與正常組相比,造模組小鼠的胸腺和脾臟均明顯減小,胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯降低,說明造模組小鼠免疫功能受到顯著抑制。

        2.2 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定

        模型組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均比正常組低(P<0.01),與模型組比較,高劑量PPS80可提高免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)(P<0.05),中、高劑量PPS80均可顯著增加免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01),且高劑量PPS80對(duì)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)的影響作用強(qiáng)于陽性對(duì)照LMS(表1)。

        表1 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響 Table 1 Effects of PPS80on thymus and spleen index in modle mice induced by CTX(± s, n=9)

        表1 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響 Table 1 Effects of PPS80on thymus and spleen index in modle mice induced by CTX(± s, n=9)

        *.與正常組比較P<0.01;#.與模型組比較P<0.05;##.與模型組比較P<0.01。

        組別 劑量/(mg·kg-1·d-1)胸腺指數(shù)/(mg·g-1)脾臟指數(shù)/(mg·g-1)- 2.071±0.112 5.099±0.357模型組 - 1.185±0.017* 2.767±0.178*PPS80(低) 100 1.245±0.049 3.325±0.283#PPS80(中) 200 1.288±0.016 3.492±0.306##PPS80(高) 400 1.314±0.006# 3.884±0.494##LMS陽性組 80 1.438±0.005## 3.651±0.037正常組##

        2.3 血清IL-2含量的檢測

        模型組血清IL-2含量遠(yuǎn)低于正常組(P<0.01),與模型組比較,低、中劑量PPS80均可提高免疫抑制小鼠血清IL-2含量(P<0.05),高劑量PPS80可顯著增加免疫抑制小鼠血清IL-2含量(P<0.01),如表2所示。

        表2 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠血清IL-2含量的影響 Table 2 Effects of PPS80on concentrations of IL-2in serum of modle mice induced by CTX(± s, n=9)

        表2 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠血清IL-2含量的影響 Table 2 Effects of PPS80on concentrations of IL-2in serum of modle mice induced by CTX(± s, n=9)

        *.與正常組比較P<0.01;#.與模型組比較P<0.05;##.與模型組比較P<0.01。

        組別 劑量/(mg·kg-1·d-1) IL-2含量/(μg·L-1)2.595±0.195模型組 - 2.024±0.044*PPS80(低) 100 2.354±0.119#PPS80(中) 200 2.355±0.121#PPS80(高) 400 2.425±0.030##LMS陽性組 80 2.519±0.031正常組 -##

        2.4 血清TNF-α含量的檢測

        模型組血清TNF-α含量遠(yuǎn)低于正常組(P<0.01),與模型組比較,中劑量PPS80可提高免疫抑制小鼠血清TNF-α含量(P<0.05),高劑量PPS80可顯著增加免疫抑制小鼠血清TNF-α含量(P<0.01),且影響作用強(qiáng)于陽性對(duì)照LMS(表3)。

        表3 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠血清TNF-α含量的影響 Table 3 Effects of PPS80on concentrations of TNF-αin serum of modle mice induced by CTX(± s, n=9)

        表3 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠血清TNF-α含量的影響 Table 3 Effects of PPS80on concentrations of TNF-αin serum of modle mice induced by CTX(± s, n=9)

        *.與正常組比較P<0.01;#.與模型組比較P<0.05;##.與模型組比較P<0.01。

        組別 劑量/(mg·kg-1·d-1) TNF-α含量/(μg·L-1)1.549±0.016模型組 - 1.339±0.030*PPS80(低) 100 1.504±0.041 PPS80(中) 200 1.535±0.028#PPS80(高) 400 1.625±0.022##正常組 -LMS陽性組 80 1.539±0.011##

        3 討論

        免疫系統(tǒng)是生物體必備的防御機(jī)構(gòu),由免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子組成。胸腺和脾臟是動(dòng)物體內(nèi)的主要免疫器官,胸腺、脾臟指數(shù)的高低能夠較為客觀地反應(yīng)機(jī)體的非特異性免疫能力。本試驗(yàn)連續(xù)3天腹腔注射CTX后,造模組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著低于正常組,說明免疫抑制小鼠模型構(gòu)建成功。在給予不同劑量PPS80治療后,與模型組相比,低、中、高劑量的PPS80均可增加免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù),且呈一定的劑量相關(guān)性。由此可見,PPS80能通過非特異性免疫調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)CTX所致的免疫抑制小鼠的免疫功能。

        IL-2是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要介質(zhì),主要由CD4+和CD8+T細(xì)胞分泌產(chǎn)生。Han S B等[4]用胸腺依賴性綿羊紅細(xì)胞(sRBCs)免疫BDF1雌性小鼠后,腹腔給予桔梗多糖發(fā)現(xiàn)能顯著提高多克隆抗體IgM的產(chǎn)生和B細(xì)胞的增殖,而不影響Th1細(xì)胞的IL-2表達(dá),而本試驗(yàn)結(jié)果顯示給予免疫抑制KM小鼠低、中、高劑量的PPS80均能顯著提高血清中IL-2含量,這可能是由于整體動(dòng)物水平與細(xì)胞水平評(píng)價(jià)差異所致,具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

        在抗腫瘤免疫反應(yīng)中,TNF-α是一類重要的細(xì)胞因子,主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌。Yoon Y D等[6]證實(shí)桔梗多糖可誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7釋放TNF-α,而Park D I等[10]報(bào)道每日口服或腹腔給予桔梗多糖組分,連續(xù)30d后可抑制ICR系雌性小鼠艾氏腹水癌生長。本試驗(yàn)結(jié)果顯示中、高劑量的PPS80均能顯著提高血清中TNF-α含量,說明PPS80能促進(jìn)免疫抑制KM小鼠的TNF-α釋放,有可能作為腫瘤治療的輔助藥物。

        總之,本試驗(yàn)結(jié)果顯示PPS80能通過增加免疫抑制小鼠胸腺、脾臟指數(shù),提高血清中IL-2和TNF-α含量從而增強(qiáng)免疫功能,這為桔梗多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

        1 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:259~260.

        2 武博,劉萍.桔梗的現(xiàn)代研究進(jìn)展 [J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測,2008,5(2):48~50.

        3 張蓮姬,南昌希,張麗霞,等.桔梗多糖的提取及其抗氧化作用研究 [J].食品與機(jī)械,2008,24(3):60~63.

        4 Han S B,Park S H,Lee K H,et al.Polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum selectively activates B cells and macrophages but not T cells[J].Int.Immunopharmacol,2001,1(11):1 969~1 978.

        5 Yoon Y D,Han S B,Kang J S,et al.Toll-like receptor 4-dependent activation of macrophages by polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum [J].Int.Immunopharmacol,2003,3(13~14):1 873~1 882.

        6 Yoon Y D,Kang J S,Han S B,et al.Activation of mitogen–activated protein kinases and AP-1by polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum in RAW 264.7cells[J].Int.Immunopharmacol,2004,4(12):1 477~1 487.

        7 賈林,沃興德,陸金健,等.桔梗多糖的提取與純化[J].生物學(xué)雜志,2011,28(2):21~24.

        8 賈林,陸金健,盧德趙,等.桔梗多糖的分離純化與含量測定[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(17):83~86.

        9 趙弋清,羅霞,陳東輝,等.不同劑量環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)正常小鼠免疫抑制的對(duì)比研究 [J].免疫學(xué)雜志,2005,21(3):122~124.

        10 Park D I,Lee J H,Moon S K,et al.Induction of apoptosis and inhibition of telomerase activity by aqueous extract from Platycodon grandiflorum in human lung carcinoma cells[J].Pharmacol Res.,2005,51(5):437~443.

        Immunoregulatory effect of polysaccharides fromPlatycodon grandiflorumA.DC on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide

        JIA Lin LU Jin-jian ZHOU Wen-ya SHI Jia-jieWO Xing-de

        (College of Life-Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou,Zhejiang310053,China)

        To study the effect of polysaccharides fromPlatycodon grandiflorumA.DC(PPS80)on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide(CTX).60male kunming mice were randomly divided into six groups:normal control,model group,PPS80lowdose treatment group(100mg/(kg·d)),PPS80middle-dose treatment group(200mg/(kg·d)),PPS80high-dose treatment group(400mg/(kg·d))and positive control group treated with levamisole hydrochloride(LMS).Immunosuppressive model was established by intraperitoneal injection of CTX at the dose of 80mg/kg,once a day for 3d.After administrated with drugs for one week,thymus index and spleen index were determined by weight.Concentrations of IL-2 and TNF-αin serum were determined by sandwich ELISA assay kits.Results PPS80significantly increased thymus and spleen index and the concentrations of IL-2and TNF-αof the serum in a dose-dependent manner.PPS80has obvious immune-improving effects on immunosuppressive mice induced by CTX.

        Platycodon grandiflorumA.DC;polysaccharides;immune enhancement;IL-2;TNF-α

        10.3969/j.issn.1003-5788.2012.03.031

        賈林(1984-),男,浙江中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士研究生。E-mail:jialin03594365790@163.com

        沃興德

        2012-01-10

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