賈 林 陸金健 周文雅 施佳杰 沃興德

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

桔梗多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)

賈 林 陸金健 周文雅 施佳杰 沃興德

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

研究桔梗多糖（PPS80）對(duì)環(huán)磷酰胺（CTX）所致免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。將60只雄性KM小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、桔梗多糖低、中、高劑量治療組（100，200，400mg／（kg·d））和鹽酸左旋咪唑（LMS）陽性組。連續(xù)3d腹腔注射環(huán)磷酰胺80mg／（kg·d）建立免疫抑制小鼠模型，于給藥治療1周后利用稱重法檢測胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，ELISA法測定血清白介素－2（IL－2）和腫瘤壞死因子－α（TNF－α）含量。結(jié)果表明，桔梗多糖能明顯增加環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，顯著提高血清中IL－2和TNF－α的含量并呈劑量依賴性。桔梗多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠具有免疫增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用。

桔梗；多糖；免疫增強(qiáng)；白介素－2；腫瘤壞死因子－α

中藥桔梗為桔?？疲╟ampanulaceae）植物桔梗（Platycodon grandiflorumA.DC）的干燥根，味苦、辛，平，用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞、肺癰吐膿［1］，現(xiàn)代研究［2］顯示其具有降血糖、降血脂、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗腫瘤、擴(kuò)張血管、抗氧化等功效。多糖作為桔梗的主要化學(xué)成分之一，文獻(xiàn)［3］報(bào)道其在體外能清除羥基自由基和超氧陰離子自由基，并對(duì)細(xì)胞水平具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用［4－6］。筆者［7］曾通過對(duì)桔梗飲片熱水浸提、乙醇分步沉淀、Sevage法脫蛋白提取得到了桔梗多糖PPS80。本試驗(yàn)旨在進(jìn)一步明確PPS80對(duì)環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）所致免疫抑制小鼠的影響，為深入研究和開發(fā)桔梗多糖提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

桔梗飲片：浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠；

KM小鼠：雄性清潔級(jí)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2007——0005；

氯化鈉注射液：杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司；

鹽酸左旋咪唑（LMS）：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；

環(huán)磷酰胺（CTX）：中國Sigma公司；

Mouse IL－2ELISA試劑盒：美國ADL公司；

Mouse TNF－αELISA試劑盒：美國ADL公司；

正丁醇、硫酸等：分析純，華東醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 主要儀器

微量振蕩器：MH－2型，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；

恒溫金屬?。篊HB－100型，杭州博日科技有限公司；

電子分析天平：AE240型，上海梅特勒－托利多儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：CR21GⅢ型，日本日立公司；

多功能酶標(biāo)儀：Spectra Max M3型，美國Dynex公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 桔梗多糖的制備 桔梗飲片60℃烘干、搗碎，過60目篩，加10倍量的蒸餾水80℃回流5次，每次2h，合并水提液，過濾，濃縮。先加入95%乙醇使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，4℃靜置10h后，3 000r／min離心10min，合并上清液；繼續(xù)加入95%乙醇，使乙醇的終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，4℃靜置10h后，3 000r／min離心10min；按Sevage法脫蛋白，于MD44－3500透析袋中蒸餾水透析48h，濃縮烘干得PPS80［7］，苯酚－硫酸法檢測糖含量為85.01%［8］。

1.3.2 動(dòng)物分組及給藥 60只雄性清潔級(jí)KM小鼠，體重18～22g。先適應(yīng)性飼養(yǎng)3d，然后隨機(jī)分為2組：正常組12只，造模組48只。按文獻(xiàn)［9］制備免疫抑制小鼠模型，即造模組連續(xù)3天腹腔注射CTX 80mg／（kg·d），正常組腹腔注射等體積氯化鈉注射液，于第4天每組各取3只檢測造模效果。造模成功后造模組隨機(jī)分為5組，每組9只：PPS80低、中、高劑量治療組分別腹腔注射100，200，400mg／（kg·d）PPS80溶液，陽性組灌胃80mg／（kg·d）LMS溶液，模型組腹腔注射等體積氯化鈉注射液，連續(xù)給藥1周。正常組每天腹腔注射等體積氯化鈉注射液。所有藥物均以氯化鈉注射液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定 末次給藥24h后，精確稱重，頸椎脫臼處死小鼠，立即分離出胸腺和脾臟并稱重，以胸腺或脾臟（mg）和體重（g）的比值表示小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)。

1.3.4 血清IL－2和 TNF－α含量的檢測 末次給藥24h后，摘除眼球取血，1 000×g離心10min取血清，采用雙抗夾心 ABC－ELISA法測定血清IL－2和 TNF－α含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作，即酶標(biāo)包被板分設(shè)為空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測血清樣品孔，空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL，標(biāo)準(zhǔn)孔依次加1 200，600，300，150，75ng／L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL，樣品孔先加樣品稀釋液40μL，再加各待測血清10μL，37℃溫育30min，每孔加入200μL以蒸餾水稀釋30倍的濃縮洗滌液洗板，靜置30s后棄去，重復(fù)5次，拍干。除空白孔外每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，37℃溫育30min，同樣操作洗板5次后拍干，每孔先加入顯色劑A 50μL，再加顯色劑B 50μL，輕震混勻，37℃避光顯色15min，每孔加50μL終止液終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，于450nm波長處檢測吸光度，根據(jù)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清IL－2和TNF－α含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均采用 Microcal origin 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 造模效果評(píng)價(jià)

造模組連續(xù)3天腹腔注射CTX 80mg／（kg·d）后，隨即各取正常組與造模組3只分離出胸腺和脾臟。與正常組相比，造模組小鼠的胸腺和脾臟均明顯減小，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均明顯降低，說明造模組小鼠免疫功能受到顯著抑制。

2.2 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的測定

模型組胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均比正常組低（P＜0.01），與模型組比較，高劑量PPS80可提高免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)（P＜0.05），中、高劑量PPS80均可顯著增加免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)（P＜0.01），且高劑量PPS80對(duì)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)的影響作用強(qiáng)于陽性對(duì)照LMS（表1）。

表1 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響 Table 1 Effects of PPS80on thymus and spleen index in modle mice induced by CTX（± s， n＝9）

表1 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響 Table 1 Effects of PPS80on thymus and spleen index in modle mice induced by CTX（± s， n＝9）

＊.與正常組比較P＜0.01；＃.與模型組比較P＜0.05；＃＃.與模型組比較P＜0.01。

組別 劑量／（mg·kg－1·d－1）胸腺指數(shù)／（mg·g－1）脾臟指數(shù)／（mg·g－1）－ 2.071±0.112 5.099±0.357模型組 － 1.185±0.017＊ 2.767±0.178＊PPS80（低） 100 1.245±0.049 3.325±0.283＃PPS80（中） 200 1.288±0.016 3.492±0.306＃＃PPS80（高） 400 1.314±0.006＃ 3.884±0.494＃＃LMS陽性組 80 1.438±0.005＃＃ 3.651±0.037正常組＃＃

2.3 血清IL－2含量的檢測

模型組血清IL－2含量遠(yuǎn)低于正常組（P＜0.01），與模型組比較，低、中劑量PPS80均可提高免疫抑制小鼠血清IL－2含量（P＜0.05），高劑量PPS80可顯著增加免疫抑制小鼠血清IL－2含量（P＜0.01），如表2所示。

表2 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠血清IL－2含量的影響 Table 2 Effects of PPS80on concentrations of IL－2in serum of modle mice induced by CTX（± s， n＝9）

表2 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠血清IL－2含量的影響 Table 2 Effects of PPS80on concentrations of IL－2in serum of modle mice induced by CTX（± s， n＝9）

＊.與正常組比較P＜0.01；＃.與模型組比較P＜0.05；＃＃.與模型組比較P＜0.01。

組別 劑量／（mg·kg－1·d－1） IL－2含量／（μg·L－1）2.595±0.195模型組 － 2.024±0.044＊PPS80（低） 100 2.354±0.119＃PPS80（中） 200 2.355±0.121＃PPS80（高） 400 2.425±0.030＃＃LMS陽性組 80 2.519±0.031正常組 －＃＃

2.4 血清TNF－α含量的檢測

模型組血清TNF－α含量遠(yuǎn)低于正常組（P＜0.01），與模型組比較，中劑量PPS80可提高免疫抑制小鼠血清TNF－α含量（P＜0.05），高劑量PPS80可顯著增加免疫抑制小鼠血清TNF－α含量（P＜0.01），且影響作用強(qiáng)于陽性對(duì)照LMS（表3）。

表3 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠血清TNF－α含量的影響 Table 3 Effects of PPS80on concentrations of TNF－αin serum of modle mice induced by CTX(± s， n＝9）

表3 PPS80對(duì)免疫抑制小鼠血清TNF－α含量的影響 Table 3 Effects of PPS80on concentrations of TNF－αin serum of modle mice induced by CTX(± s， n＝9）

＊.與正常組比較P＜0.01；＃.與模型組比較P＜0.05；＃＃.與模型組比較P＜0.01。

組別 劑量／（mg·kg－1·d－1） TNF－α含量／（μg·L－1）1.549±0.016模型組 － 1.339±0.030＊PPS80（低） 100 1.504±0.041 PPS80（中） 200 1.535±0.028＃PPS80（高） 400 1.625±0.022＃＃正常組 －LMS陽性組 80 1.539±0.011＃＃

3 討論

免疫系統(tǒng)是生物體必備的防御機(jī)構(gòu)，由免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子組成。胸腺和脾臟是動(dòng)物體內(nèi)的主要免疫器官，胸腺、脾臟指數(shù)的高低能夠較為客觀地反應(yīng)機(jī)體的非特異性免疫能力。本試驗(yàn)連續(xù)3天腹腔注射CTX后，造模組小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著低于正常組，說明免疫抑制小鼠模型構(gòu)建成功。在給予不同劑量PPS80治療后，與模型組相比，低、中、高劑量的PPS80均可增加免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，且呈一定的劑量相關(guān)性。由此可見，PPS80能通過非特異性免疫調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)CTX所致的免疫抑制小鼠的免疫功能。

IL－2是一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)，主要由CD4＋和CD8＋T細(xì)胞分泌產(chǎn)生。Han S B等［4］用胸腺依賴性綿羊紅細(xì)胞（sRBCs）免疫BDF1雌性小鼠后，腹腔給予桔梗多糖發(fā)現(xiàn)能顯著提高多克隆抗體IgM的產(chǎn)生和B細(xì)胞的增殖，而不影響Th1細(xì)胞的IL－2表達(dá)，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示給予免疫抑制KM小鼠低、中、高劑量的PPS80均能顯著提高血清中IL－2含量，這可能是由于整體動(dòng)物水平與細(xì)胞水平評(píng)價(jià)差異所致，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

在抗腫瘤免疫反應(yīng)中，TNF－α是一類重要的細(xì)胞因子，主要由單核－巨噬細(xì)胞分泌。Yoon Y D等［6］證實(shí)桔梗多糖可誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7釋放TNF－α，而Park D I等［10］報(bào)道每日口服或腹腔給予桔梗多糖組分，連續(xù)30d后可抑制ICR系雌性小鼠艾氏腹水癌生長。本試驗(yàn)結(jié)果顯示中、高劑量的PPS80均能顯著提高血清中TNF－α含量，說明PPS80能促進(jìn)免疫抑制KM小鼠的TNF－α釋放，有可能作為腫瘤治療的輔助藥物。

總之，本試驗(yàn)結(jié)果顯示PPS80能通過增加免疫抑制小鼠胸腺、脾臟指數(shù)，提高血清中IL－2和TNF－α含量從而增強(qiáng)免疫功能，這為桔梗多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Immunoregulatory effect of polysaccharides fromPlatycodon grandiflorumA.DC on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide

JIA Lin LU Jin－jian ZHOU Wen－ya SHI Jia－jieWO Xing－de

（College of Life－Science，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou，Zhejiang310053，China）

To study the effect of polysaccharides fromPlatycodon grandiflorumA.DC（PPS80）on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide（CTX）.60male kunming mice were randomly divided into six groups：normal control，model group，PPS80lowdose treatment group（100mg／（kg·d）），PPS80middle－dose treatment group（200mg／（kg·d）），PPS80high－dose treatment group（400mg／（kg·d））and positive control group treated with levamisole hydrochloride（LMS）.Immunosuppressive model was established by intraperitoneal injection of CTX at the dose of 80mg／kg，once a day for 3d.After administrated with drugs for one week，thymus index and spleen index were determined by weight.Concentrations of IL－2 and TNF－αin serum were determined by sandwich ELISA assay kits.Results PPS80significantly increased thymus and spleen index and the concentrations of IL－2and TNF－αof the serum in a dose－dependent manner.PPS80has obvious immune－improving effects on immunosuppressive mice induced by CTX.

Platycodon grandiflorumA.DC；polysaccharides；immune enhancement；IL－2；TNF－α

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.031

賈林（1984－），男，浙江中醫(yī)藥大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：jialin03594365790＠163.com

沃興德

2012－01－10