楊依錦 王俊平 王 津 方淑兵 王 碩

（1.食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué)，天津 300457）

重金屬鉛酶聯(lián)免疫檢測方法的研究

楊依錦1，2王俊平1，2王 津1，2方淑兵1，2王 碩1，2

（1.食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.天津科技大學(xué)，天津 300457）

制備鉛離子多克隆抗體，并建立間接競爭ELISA檢測方法。利用雙功能螯合劑ITCBE將Pb2＋與載體蛋白KLH和BSA偶聯(lián)在一起，制備免疫抗原與檢測抗原；通過免疫新西蘭大耳白免成功制備鉛多克隆抗體，建立間接競爭ELISA檢測方法，并與ICP－MS檢測結(jié)果進(jìn)行比較。標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50為3.48ng／mL，IC15為0.32ng／mL，與ICP－MS法檢測結(jié)果的總符合率超過97%。

鉛；多克隆抗體；間接競爭ELISA

重金屬是一種常見的污染源，其中鉛的污染又尤為嚴(yán)重，對環(huán)境與人類造成了嚴(yán)重的危害。鉛的毒性很強(qiáng)，是重金屬污染中的“五毒”之一。它對人體的毒性作用包括神經(jīng)毒性、腎臟毒性、造血系統(tǒng)毒性、心血管系統(tǒng)毒性、生殖系統(tǒng)毒性、關(guān)節(jié)毒性、內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性以及胃腸道和肝臟的毒性等，還會對兒童的生長發(fā)育產(chǎn)生影響［1－3］。

目前檢測鉛離子的主要方法有原子熒光光度法（AFS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP－MS）分析技術(shù)、電感耦合等離子原子發(fā)射光譜（ICP－AES）、高效液相色譜法（HPLC）等［4－8］，這些檢測方法所需的儀器較昂貴，操作復(fù)雜，需要專業(yè)的工作人員。重金屬免疫學(xué)檢測方法是通過制備重金屬的特異性抗體，利用抗原－抗體反應(yīng)進(jìn)行的快速、準(zhǔn)確的檢測方法，與傳統(tǒng)檢測技術(shù)相比有著快速，簡單，價格低廉，適合現(xiàn)場監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)擬建立重金屬鉛間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，同時將其用于實(shí)際樣品添加回收的試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

鉛溶液、鎘溶液、汞溶液、鐵溶液、鉻溶液、鎳溶液、銅溶液、鎂溶液、銀溶液、錳溶液：中國國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；

1－（4－異硫氰酸芐基）－乙二胺四乙酸（ITCBE）：上海同仁化學(xué)研究所；

鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）、牛血清蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜（DMSO）、N－（2－羥乙基）哌嗪－N′－2－乙烷磺酸（HEPES）：美國Sigma公司；

濃硝酸、高氯酸：優(yōu)級純，天津市化學(xué)試劑一廠；

自來水、海河水：采自天津本地；

白芷：購自天津某藥房；

胡蘿卜、皮皮蝦：購自天津某超市。

1.1.2 儀器

酶標(biāo)儀：Thermo 1500，美國Thermo公司；

蛋白純化儀：BioLogic LP，美國BIO－RAD公司；

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP－MS）：7500cx（G3272B），美國 Agilent公司；

高壓消解罐：LTG－PTFE，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備 抗原采用雙功能螯合劑1－（4－異硫氰酸芐基）－乙二胺四乙酸（ITCBE）將重金屬鉛和鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）相連。取1.5mg ITCBE溶于1mL二甲基亞砜（DMSO）中，取標(biāo)準(zhǔn)硝酸鉛溶液（1 000mg／L Pb2＋）0.7mL。將ITCBE緩慢滴加入Pb（NO3）2溶液中，用三乙胺將pH調(diào)到中性，常溫反應(yīng)過夜。取10mg KLH溶于pH 9.0的N－（2－羥乙基）哌嗪－N′－2－乙烷磺酸（HEPES）緩沖溶液中，將螯合好的Pb－ITCBE結(jié)合物緩慢滴加入蛋白溶液中，反應(yīng)過程中，保持pH在8.0～9.0（用三乙胺調(diào)pH，使其值的穩(wěn)定）。室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后在10mmol／L的pH為7.4的HEPES緩沖溶液中進(jìn)行透析，除去未反應(yīng)的小分子。放入－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 包被抗原的制備 包被原采用雙功能螯合劑ITCBE將重金屬鉛和牛血清蛋白（BSA）相連。取1.5mg ITCBE溶于500μL DMSO 中，取 標(biāo) 準(zhǔn) 硝 酸 鉛 溶 液 （1 000mg／L Pb2＋）0.7mL。將ITCBE緩慢滴加入Pb（NO3）2溶液中，用三乙胺將pH調(diào)到中性，常溫反應(yīng)過夜。取10mg BSA溶于pH 9.0的 HEPES緩沖溶液中（2mL），將螯合好的Pb－ITCBE結(jié)合物緩慢滴加入蛋白溶液中，反應(yīng)過程中，保持pH在8.0～9.0。室溫反應(yīng)過夜。反應(yīng)完全后在10mol／L的pH為7.4的HEPES緩沖溶液中進(jìn)行透析，除去未反應(yīng)的小分子。放入－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抗體的制備 將制備好的免疫原同時免疫兩只新西蘭大耳白兔，初次免疫時，需將免疫抗原與完全弗氏佐劑按1∶1的體積比制備成“油包水”的乳液狀，每只兔子的免疫劑量為1.0mg（用0.9%的生理鹽水將免疫抗原稀釋為1mg／mL的濃度）。第一次免疫時采取的是背部皮下多點(diǎn)注射和腿部肌肉注射。分別于初次免疫后2，4，8周加強(qiáng)免疫3次，每只兔子免疫劑量減半。在第3、4次免疫后的7～10d，進(jìn)行耳靜脈采血測定抗血清效價和親和性，當(dāng)抗血清效價與親和性不再增加時采用股動脈采血法取全血［9］。本試驗(yàn)采用免疫親和層析法進(jìn)行抗體純化，用Sepharose 4B－Protein A作親和層析介質(zhì)純化抗血清，所得抗體用PBS透析后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重金屬鉛間接競爭ELISA檢測方法的建立

（1）包被抗原的包被：用包被液將包被原稀釋至1μg／mL，以100μg／孔的量包被在96孔酶標(biāo)板上，4℃過夜孵育（12～16h），第2天將孔中液體棄去，然后用PBST溶液洗板3次。

（2）封閉：封閉液使用0.5%的脫脂乳粉溶液（200μg／孔），37℃恒溫烘箱孵育1h。棄去封閉液后用PBST溶液洗板3次。

（3）加樣：每孔先加入50μL螯合后的重金屬標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品提取液，然后加入50μL抗體稀釋液（用PBS緩沖液稀釋）。室溫下在搖床震蕩競爭反應(yīng)1h，然后用PBST溶液洗板3次。

（4）加酶標(biāo)二抗：加入用PBS稀釋至10 000倍的酶標(biāo)二抗（100μg／孔），室溫孵育30min后，棄去二抗，然后用PBST溶液洗板3次。

（5）顯色：每孔中加入100μL的底物液（底物A與TMB的混合溶液），室溫下反應(yīng)20min。

（6）終止：每孔中加入50μL的終止液（1.25M的濃硫酸），終止反應(yīng)。

（7）讀取吸光度值：在雙波長方式（450～650nm）下用酶標(biāo)儀讀取吸光度值（OD值）。

（8）抑制率的計算：按式（1）進(jìn)行。

式中：

R—— 抑制率，%；

OD對照—— 不加標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值，即只加抗體的吸光值；

OD空白——不加標(biāo)準(zhǔn)品和抗體的吸光值，即只加PBS的吸光值；

OD——加了抗體和不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品混合物的吸光值。

以重金屬鉛的濃度取對數(shù)后為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制出重金屬鉛的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 抗體特異性的測定 本試驗(yàn)選擇了ITCBE螯合后的金屬汞（Hg）、鎘（Cd）、鉻（Cr）、銀（Ag）、錳（Mn）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鎂（Mg）、鐵（Fe）及單獨(dú)的螯合劑ITCBE進(jìn)行交叉反應(yīng)的測定，計算出各個競爭物的IC50值，得出它們與重金屬鉛（Pb）抗體的交叉反應(yīng)率，以此判斷抗體的特異性。

交叉反應(yīng)率的計算：按式（2）進(jìn)行。

式中：

CR—— 交叉反應(yīng)率，%；

IC50對照——其他重金屬螯合后所測得的IC50值；

IC50測定——重金屬鉛螯合后所測得的IC50值。

1.2.6 樣品處理及基質(zhì)影響的消除

（1）自來水樣和海河水樣：自來水經(jīng)PBS緩沖液稀釋5倍后，可消除基質(zhì)影響；海河水需過0.22μm的水膜后，再用PBS緩沖液稀釋8倍，可消除基質(zhì)影響。

（2）其他樣品（中藥白芷、胡蘿卜、皮皮蝦）：將樣品烘干后，粉碎成粉末，稱取1g，使用強(qiáng)酸（濃硝酸10mL，高氯酸5mL）浸泡12h，第2天在高溫（160～180℃）下硝化至溶液澄清，選用Tris－HCl將pH調(diào)至中性，然后過0.22μm的水膜，用雙蒸水定容稀釋60倍，可消除基質(zhì)影響。

1.2.7 樣品添加回收 每100mL自來水樣品中分別添加濃度為1mg／mL的重金屬Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2，2，6.5μL，最終添加的量分別為0.2，2，6.5μg，添加完后，與螯合劑ITCBE按摩爾比1∶1的比例進(jìn)行螯合，經(jīng)PBS緩沖液稀釋5倍后，然后進(jìn)行ic－ELISA測定；每100mL海河水樣品中分別添加濃度為1mg／mL重金屬Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液0.32，3.2，10.4μL，最終添加的量分別為0.32，3.2，10.4μg，添加完后，需過0.22μm的水膜，與螯合劑ITCBE按摩爾比1∶1的比例進(jìn)行螯合后，再用PBS緩沖液稀釋8倍，然后進(jìn)行ic－ELISA測定；其他基質(zhì)樣品處理為粉末后向其中每1g樣品中分別添加濃度為1mg／mL的重金屬 Pb標(biāo)準(zhǔn)溶液0.024，0.24，0.78μL，最終添加的量分別為0.024，0.240，0.78μg，之后按1.2.6所述方法進(jìn)行硝化后，與螯合劑ITCBE按摩爾比1∶1的比例進(jìn)行螯合，稀釋后進(jìn)行ic－ELISA測試，上述每個添加濃度都做3個平行試驗(yàn)。

回收率按式（3）計算：

式中：

Re—— 回收率，%；

C測定—— 實(shí)際測出的濃度；

C空白——未添加標(biāo)品所測出的濃度；

C添加—— 實(shí)際添加的濃度。

1.2.8 儀器驗(yàn)證 本試驗(yàn)采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP－MS）對建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。按照步驟1.2.7的方法對基質(zhì)進(jìn)行添加后，同時用建立的ic－ELISA方法和ICPMS方法進(jìn)行檢測，并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 建立的ic－ELISA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在建立的間接競爭ELISA方法下，將螯合后的Pb標(biāo)品從200ng／mL開始5倍梯度稀釋，稀釋6個濃度，得到不同濃度Pb標(biāo)品的OD值，根據(jù)式（1）計算抑制率，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 重金屬鉛ic－ELISA檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of lead on ic－ELISA

由圖1可知，靈敏度IC50為（3.48±0.09）ng／mL，最低檢出限IC15為（0.32±0.02）ng／mL。

2.2 抗體特異性

本試驗(yàn)中交叉反應(yīng)結(jié)果見表1。

表1 重金屬鉛的交叉反應(yīng)Table 1 Cross－reactivity of lead

由表1可知，該抗體與其他金屬和螯合劑ITCBE的親和性較低，對重金屬鉛有較高的特異性。

2.3 樣品處理與基質(zhì)消除

根據(jù)1.2.6所述，處理樣品后，所得到的基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

一般認(rèn)為相同濃度下標(biāo)準(zhǔn)曲線的抑制率與基質(zhì)曲線的抑制率相差小于20%就可認(rèn)定為基質(zhì)影響基本消除。由圖2可知，經(jīng)過處理后的基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，說明基質(zhì)影響已消除。

2.4 回收率

由表2可知，對于自來水、海河水、中藥白芷、胡蘿卜、皮皮蝦基質(zhì)的回收率都在78.5%～121%，表明建立的間接ELISA檢測法符合準(zhǔn)確度的要求。

2.5 儀器驗(yàn)證

本試驗(yàn)建立的間接競爭ELISA方法與ICP－MS檢測法的相關(guān)性試驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，兩種方法檢測結(jié)果一致性較高，線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.976。結(jié)果充分表明了本試驗(yàn)建立的重金屬鉛間接ELISA檢測方法結(jié)果的準(zhǔn)確性，并且試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

圖2 基質(zhì)影響的消除Figure 2 Eliminate of the matrix influence（ n＝3）

表2 重金屬鉛ic－ELISA檢測法添加回收率表Table 2 Recovery studies of lead at three levels by ic－ELISA

圖3 ic－ELISA和ICP－MS測定結(jié)果相關(guān)性曲線Figure 3 Correlations between ic－ELISA and ICP－MS results

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用雙功能螯合劑ITCBE使得重金屬鉛與蛋白相連制備成免疫原后，成功獲得高特異性的重金屬鉛多克隆抗體。建立的重金屬鉛間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的靈敏度為IC50＝（3.48±0.09）ng／mL，最低檢出限為IC15＝（0.32±0.02）ng／mL，線性范圍為0.32～53.49ng／mL（此處以抑制率15%～90%為線性范圍），相關(guān)系數(shù)R2值為0.999。

以ICP－MS檢測方法為標(biāo)準(zhǔn)，對建立的重金屬鉛間接競爭ELISA檢測方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行了驗(yàn)證，線性相關(guān)系數(shù)R2值為0.976，結(jié)果證明了建立的重金屬鉛間接競爭ELISA檢測方法具有較高的準(zhǔn)確性。

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Development of enzyme－linked immunosorbent assay for heavy metal lead

YANG Yi－jin1，2WANG Jun－ping1，2WANG Jin1，2FANG Shu－bing1，2WANG Shuo1，2

（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，Tianjin300457，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457，China）

To prepare polyclonal antibody against heavy metal lead ion and develop an indirect competitive ELISA method.Lead was coupled to vector proteins keyhole limpet hemocyanin（KLH）and bovine serum albumin（BSA）via a bifunctional chelating agent ITCBE respectively，Pb（Ⅱ）－ITCBE－KLH was used as immunogen and Pb（Ⅱ）－ITCBE－BSA was used as coating antigen.The anti－Pb antibody was obtained after immunized to New Zealand white rabbits and an indirect competitive ELISA method was developed，by which the determination result was compared with that by ICP－MS method.The standard curve was developed with IC50of 3.48ng／mL and IC15of 0.32ng／mL，the total coincidence rate of the developed ELISA method and ICP－MS method was more than 97%.

heavy metal lead；polyclonal antibody；ic－ELISA

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.022

楊依錦（1987－），女，天津科技大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：yyj870319＠163.com

王碩

2012－01－11