洪雪梅，林毅

（1.華僑大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

新型殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4空間結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)解析

洪雪梅1，林毅2

（1.華僑大學(xué) 信息科學(xué)與工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門 361021）

采用一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及同源比對(duì)建模的方法，模擬出新型殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4的空間結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行動(dòng)力學(xué)優(yōu)化.結(jié)合其殺大猿葉甲活性數(shù)據(jù)與蛋白結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)Cry7Ab4與Cry7Aa1的活性差異主要?dú)w因于α3，α4上疏水性氨基酸的不同.

蘇云金芽孢桿菌；殺蟲(chóng)晶體蛋白；Cry7Ab4；空間結(jié)構(gòu)；構(gòu)效關(guān)系

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）伴孢晶體蛋白Cry7在對(duì)鱗翅目、鞘翅目和直翅目等害蟲(chóng)的生物防治方面有著廣闊的前景.如Cry7Aa殺馬鈴薯甲蟲(chóng)（Leptinotarsa decemlineata），其半數(shù)致死濃度（LC50）為13.1μg·mL－1［1］；Cry7Ba1殺小菜蛾（Plutella xylostella），3d的 LC50值為0.095 7μg·mL－1；Cry7Ca1殺蝗蟲(chóng)，72h的LC50值為3.19μg·mL－1［2］.Cry7基因殺蟲(chóng)活性高，但Cry7Ab4對(duì)鱗翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾（Spadoptera exigua）、亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、馬鈴薯甲蟲(chóng)（Leptinotarsa decemlineata）、榆藍(lán)葉甲（Pyrrhalta aenescens）和直翅目的東亞飛蝗（Oroental migratory locust）基本無(wú)殺蟲(chóng)活性，僅對(duì)鞘翅目的大猿葉甲（Colaphellus bowvingi Baly）有殺蟲(chóng)活性，其LC50值為293.79μg·mL－1［3］.未做酶解的蛋白基本無(wú)殺蟲(chóng)活性，有活性的只有trypsin酶解的蛋白.在Cry7Ca基因也有相似情況：酶解蛋白72h的LC50值為3.19μg·mL－1，而未酶解蛋白72h的LC50值為9.4μg·mL－1，酶解蛋白比未酶解蛋白活性高了3倍［2］.因此，解析Cry7蛋白的空間結(jié)構(gòu)，探討構(gòu)效關(guān)系，具有重大意義.Cry7Ab4是從蘇云金芽孢桿菌HQ40中克隆的一個(gè)新基因（登錄號(hào)為EU380678），其編碼產(chǎn)物的蛋白酶解液對(duì)鞘翅目的大猿葉甲有殺蟲(chóng)活性，其LC50值為293.79μg·mL－1［3］.為探討其構(gòu)效關(guān)系，本研究采用同源建模并經(jīng)動(dòng)力學(xué)優(yōu)化獲得了Cry7Ab4的空間結(jié)構(gòu)，通過(guò)與Cry7Aa1的比較分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大猿葉甲的活性差異主要?dú)w因于α3，α4上疏水性氨基酸的不同.

1 材料與方法

1.1 材料

供試蛋白質(zhì)（Cry7Ab4）序列為文獻(xiàn)［3］實(shí)驗(yàn)篩選測(cè)序獲得的.

1.2 分析方法

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)采用PHD（http：∥www.embl2.heidelberg.de／predict.protein／p－redictpro2tein.html），利用protparam（http：∥au.expasy.org／tools／protparam.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)，利用SWISS－MODEL服務(wù)器（http：∥www.expasy.org／swiss－mod／－SWISS－MODEL.html）進(jìn)行同源建模.SMART服務(wù)器（http：∥smart.embl－h(huán)eidelberg.de／）進(jìn)行對(duì)結(jié)構(gòu)域分析，包括3個(gè)DOMAIN的位置.SeqFacts服務(wù)器（http：∥bip.weizmann.ac.il／sqfbin／seqfacts）CDD v2.10服務(wù)器（http：∥www.ncbi.nlm.n－ih.gov／Structure／cdd／cdd.shtml）可找出提交序列的保守區(qū)域.分子模型優(yōu)化采用ICM軟件.圖片編輯采用可視化工具Chimera，Spdbv與Rasmol.BLAST（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／）進(jìn)行序列比對(duì)，或利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì).

2 結(jié)果與分析

2.1 殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4氨基酸序列分析

2.1.1 殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4氨基酸組成 將殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4的一級(jí)序列提交給Protparam服務(wù)器，可得到該蛋白（核心毒蛋白，已截去C端和N端的部分序列）的氨基酸組成，如圖1所示.該蛋白含585個(gè)氨基酸，其中異亮氨（Ile）、亮氨酸（Leu）、絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）的比例（γ）最高，分別為7.52%，7.86%，8.03%，7.69%.該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為66.79kDa，理論上的pI值為5.86，是弱酸性蛋白.

圖1 殺蟲(chóng)蛋白Cry7Ab4核心毒蛋白的20種氨基酸組成Fig.1 Amino acids composition of core toxic protein of Cry7Ab4

2.1.2 殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 采用PHD程序?qū)⑾x(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè).結(jié)果表明，在該蛋白中各二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的摩爾分?jǐn)?shù)：α－螺旋（177AA）為27.96%，延伸鏈（144AA）為22.75%，隨機(jī)卷曲（312AA）為49.29%.在含585個(gè)氨基酸殘基的Cry7Ab4蛋白中，大概存在7個(gè)較長(zhǎng)的α－螺旋區(qū)域，這些區(qū)域（約30～260）主要分布在該蛋白的N－端，其后區(qū)域則為β－折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，β－折疊相對(duì)較對(duì)較密地分布在C－端.

2.1.3 殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4的結(jié)構(gòu)域及功能位點(diǎn) 采用SMART（正常形式）用于發(fā)現(xiàn)和注釋遺傳可移動(dòng)蛋白多肽中的結(jié)構(gòu)域（domain）及分析結(jié)構(gòu)域（domain）的體系結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示.

圖2 殺蟲(chóng)蛋白Cry7Ab4的結(jié)構(gòu)域信息Fig.2 Information of Cry7Ab4domains

根據(jù)已知的幾種殺蟲(chóng)晶體蛋白的結(jié)構(gòu)，提出如下列推測(cè).Cry蛋白DomainⅠ的長(zhǎng)疏水和親水脂螺旋可能參與中腸上皮溶細(xì)胞孔洞的形成；DomainⅡ的3個(gè)β－折疊頂部暴露在表面的環(huán)結(jié)構(gòu)，由于與免疫球蛋白抗原結(jié)合位點(diǎn)相似，其中可能含有毒素結(jié)合到昆蟲(chóng)中腸刷狀緣膜上特異性受體的決定性因子，參與起始與受體結(jié)合.定點(diǎn)誘變與片段互換研究都支持這一推斷［4］；DomainⅢ的β－“三明治”結(jié)構(gòu)具有多種功能，在毒素分子的生物化學(xué)上，可以維持毒素分子三維結(jié)構(gòu)的完整［5］，毒素與受體的相互作用導(dǎo)致形成孔洞.研究表明：β－“三明治”結(jié)構(gòu)能夠參與受體結(jié)合［6］、膜穿透［7］和離子通道功能［8］.

2.2 殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4空間結(jié)構(gòu)的同源建模及優(yōu)化

將殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4序列提交到Swiss Model服務(wù)器，在Tools中的Template Identification中尋找到具有晶體結(jié)構(gòu)的模板，發(fā)現(xiàn)其同源性最高為40%，PDB的ID號(hào)1dlcA（insecticidal crystal protein Cry2Aa）.將殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4與模板1dlcA＿B2的氨基酸序列比對(duì)，由于同源性較低，在進(jìn)行同源建模時(shí)可采用比對(duì)建模，其模板為1dlcA.提交殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4與模板1dlcA的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果到Swiss－Model服務(wù)器，進(jìn)行自動(dòng)建模，同源模建返回的初始結(jié)構(gòu)在ICM可視化.

對(duì)同源模建的Cry7Ab4初始三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和動(dòng)力學(xué)模擬，先用最陡下降法 （steepest descent）在CVFF（consistent－valence forcefield）力場(chǎng)下進(jìn)行100步的結(jié)構(gòu)松弛計(jì)算，接著采用200步的共軛梯度法（conjugate gradient）進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，最終把Ramachadran Plot得分控制在92%以上，得到一個(gè)比較可靠的三維結(jié)構(gòu)圖，如圖3所示.

圖3 同源模建修正后Cry7Ab4三維結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of Cry7Ab4 modified by homologous modeling

2.3 Cry7Ab4與Cry7Aa1的結(jié)構(gòu)差異

目前已發(fā)現(xiàn)的Cry7A類基因共6種，其中Cry7Ab基因共5種.在這些已發(fā)現(xiàn)的Cry7A類基因中，殺蟲(chóng)活性生測(cè)比較多的是Cry7Aa1，它對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，其他蛋白殺蟲(chóng)活性未見(jiàn)報(bào)道.通過(guò)序列比對(duì)（圖4），Cry7Ab4與Cry7Aa1的同源性為93.84%，部分差異氨基酸如表1所示.

圖4 殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4與Cry7Aa1多序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 Alignment of the amino acid sequence between Cry7Ab4and Cry7Aa1toxins

由表1可知：殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry7Ab4與Cry7Aa1主要氨基酸差異多處位于結(jié)構(gòu)域Ⅰ，共有41個(gè)氨基酸差異，Cry7Ab4蛋白有17個(gè)親水性氨基酸，占差異氨基酸總數(shù)的41.46%，Cry7Ab1蛋白有21個(gè)親水性氨基酸，占差異氨基酸總數(shù)的51.22%.Cry7Ab4中親水性氨基酸明顯低于Cry7Aa1，低了9.7個(gè)百分點(diǎn).

表1 Cry7Ab4與Cry7Aa1空間結(jié)構(gòu)上對(duì)應(yīng)的氨基酸差異Tab.1 Amino acid difference between Cry7Ab4and Cry7Aa1in single domains

在這兩個(gè)模型中的共同點(diǎn)是結(jié)構(gòu)域Ⅰ與蛋白在害蟲(chóng)細(xì)胞膜上的鉆孔活動(dòng)有關(guān)，α5，α6和頂部的環(huán)狀結(jié)構(gòu)為疏水性氨基酸與鉆孔有關(guān)，其他部分為親水性氨基酸，位于周圍液態(tài)環(huán)境中，促進(jìn)鉆孔后與細(xì)胞膜的結(jié)合穩(wěn)定性.這部分的氨基酸親水性越強(qiáng)，殺蟲(chóng)晶體蛋白與細(xì)胞膜的結(jié)合越穩(wěn)定，所以殺蟲(chóng)活性相對(duì)也就強(qiáng).

比較Cry7Ab4與Cry7Ab1的空間結(jié)構(gòu)時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們之間的氨基酸差異主要分布在α3，α4兩個(gè)親水性螺旋上，如圖5所示.在本研究中，可以發(fā)現(xiàn)Cry7Ab4的殺蟲(chóng)活性（LC50）為293.79μg·mL－1，而Cry7Ab1的殺蟲(chóng)活性（LC50）為 13.1μg·mL－1，Cry7Ab1的殺蟲(chóng)活性高于Cry7Ab4，其原因可能與這部分氨基酸的親水性有關(guān).

圖5 差異氨基酸在Cry7Ab4中的分布圖Fig.5 Distribution of the diversity amino acids in Cry7Ab4

3 討論

殺蟲(chóng)活性模型有兩個(gè)，一是“umbrella”模型，Cry蛋白DomainⅠ的疏水α4，α5螺旋形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)起始孔洞的形成.1997年，Schwartz等［9］在 Cry1Ab蛋白 DomainⅠ和DomainⅠ與DomainⅡ之間引入二硫鍵限制分子內(nèi)運(yùn)動(dòng).研究結(jié)果表明：α4，α5螺旋的發(fā)夾結(jié)構(gòu)插入上皮膜，DomainⅠ的其他部分以“傘狀”平鋪于膜表面.1999年，Yaoi等［10］分析了 Cry1Aa蛋白與家蠶（Bombyx mori）氨肽酶（Aminopeptidase N，APN）的結(jié)合區(qū)，證明是位于DomainⅠ的135－Ile和198－Pro之間，也就是α4，α5螺旋.Masson等［11］研究了Cry1Aa蛋白DomainI的α4螺旋的各位點(diǎn)突變對(duì)小菜蛾（Plutella xylostella）結(jié)合的影響，發(fā)現(xiàn)α4螺旋帶電荷的Asp－136是維持Cry1Aa對(duì)小菜蛾毒性最重要的位點(diǎn).2000年，Gerber等［12］進(jìn)一步誘變Cry1Ac DomainⅠ的α4，α5螺旋間的loop，也證明α4，α5螺旋與孔洞形成有關(guān).

另一個(gè)模型是1990年Hodgman和Ellar［13］提出的“鉛筆刀”模型.疏水α5，α6加上頂部的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，打開(kāi)成“鉛筆刀”形式插入上皮膜，其余部分在膜或受體表面.目前這個(gè)模型的證據(jù)較少.這兩個(gè)模型都表明殺蟲(chóng)晶體蛋白空間結(jié)構(gòu)上的αα螺旋是非常關(guān)鍵的區(qū)域.

本研究通過(guò)系統(tǒng)的分析發(fā)現(xiàn)，Cry7Ab4與Cry7Ab1之間的氨基酸差異主要分布在α3，α4兩個(gè)親水性螺旋上，據(jù)此推測(cè)其殺蟲(chóng)活性差異主要?dú)w因于α3，α4螺旋的親水性差異.研究結(jié)果與上述兩個(gè)模型所揭示的αα螺旋是Cry蛋白上極其關(guān)鍵的區(qū)域的事實(shí)相吻合.今后可圍繞Cry7Ab蛋白的的αα螺旋區(qū)域，實(shí)施隨機(jī)和定點(diǎn)突變，進(jìn)一步深入探討其構(gòu)效關(guān)系.

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Structural Analysis of a Novel Insecticidal Crystal Protein Cry7Ab4

HONG Xue－mei1，LIN Yi2

（1.College of Information Science and Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China；2.College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

The initial spatial structure of a novel insecticidal crystal protein Cry7Ab4was constructed by primary structure analysis，secondary structure prediction and homologous alignment modeling，and then optimized by molecular mechanics method.In addition，the structural difference between Cry7Ab4and Cry7Ab1was compared by NCBI Blastp.It showed that the hydrophobic amino acids inα3，α4were responsible for their difference of insecticidal activities against Colaphellus bowringi.

Bacillus thuringiensis；insecticidal crystal protein；Cry7Ab4；spatial structure；structure－activity relationship

錢筠 英文審校：劉源崗）

Q 518.1；TP 311.1

A

1000－5013（2012）01－0060－05

2011－09－13

林毅（1976－），男，教授，主要從事伴孢晶體蛋白的基因克隆與信息學(xué)的研究.E－mail：lyhxm＠hqu.edu.cn.

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（211205）；福建省高等學(xué)校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（2006年度）；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011J01221）；植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目（2007IP7）