李琳琳，高 佳，楊翔華，王戰(zhàn)勇

（遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧撫順 113001）

門多薩假單胞菌DS04-T對(duì)Poly（3HB-co-4HB）的降解研究

李琳琳，高 佳，楊翔華，王戰(zhàn)勇

（遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧撫順 113001）

考察了門多薩假單胞菌 DS04-T 對(duì) Poly（3HB-co-4HB）的降解行為。以 Poly（3HB-co-4HB）為唯一碳源，分別考察培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、培養(yǎng)基起始p H值、接種量等因素對(duì)降解行為的影響。結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得了菌株的最佳產(chǎn)酶條件：培養(yǎng)時(shí)間為28 h，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)基初始p H值為7.3，搖床轉(zhuǎn)速為150 r／min，培養(yǎng)基裝液量為120 m L（250 m L三角瓶），接種量為1.5%（體積分?jǐn)?shù)），此條件下菌株對(duì) Poly（3HB-co-4HB）的降解酶活力可達(dá)（26.2±0.7）U·m L－1。

門多薩假單胞菌；Poly（3HB-co-4HB）；降解；酶活力

聚羥基脂肪酸酯（PHA，polyhydroxyalkanoates）是近20多年迅速發(fā)展起來(lái)的生物高分子材料，是很多微生物合成的一種細(xì)胞內(nèi)聚酯，是一種天然的高分子生物材料［1］。由于PHA具有良好的生物降解性和生物相容性，可由微生物發(fā)酵生產(chǎn)，已引起材料領(lǐng)域越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注，被認(rèn)為是環(huán)境友好的生物可降解塑料［2－3］。聚（3-羥 基 丁 酸 酯-co-4-羥 基 丁 酸 酯）即 poly（3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate）或 Poly（3HB-co-4HB）］，是PHA的一種。Poly（3HB-co-4HB）是一種典型的半結(jié)晶聚合物，它主要由2種共聚物構(gòu)成，即富3 HB微區(qū)Poly（3 HB-co-4 HB）共聚物和富4 HB微區(qū)的Poly（3 HB-co-4 HB）共聚物［4］。微生物降解技術(shù)成本低廉，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的環(huán)境治理技術(shù)［5－6］。Poly（3HB-co-4HB）作為生物可降解塑料，雖具有良好降解特性，其廢棄物能夠在環(huán)境中實(shí)現(xiàn)完全降解，不會(huì)造成環(huán)境污染。但實(shí)際上Poly（3HB-co-4HB）在天然環(huán)境中的降解相對(duì)緩慢，這就要求在其應(yīng)用后對(duì)其進(jìn)行必要的降解處理。本研究初步考察了門多薩假單胞菌DS04-T菌株對(duì)Poly（3 HB-co-4HB）的降解行為，為其進(jìn)一步的應(yīng)用和降解提供相關(guān)的基礎(chǔ)研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

門多薩假單胞菌（pseudomonasmendocina）DS04-T，筆者實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及培養(yǎng)基

Poly（3HB-co-4HB）由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所提供；其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

基本培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：NH4Cl（0.1%）；MgSO4·7H2O（0.05%）；CaCl2·2H2O（0.000 5%）；KH2PO4（0.554%）；Na2HPO4·12H2O（1.194%）。

發(fā)酵培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加Poly（3HB-co-4HB）（0.15%），即為發(fā)酵培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：胰蛋白胨（1.0%）；酵母粉（0.5%）；NaCl（1.0%）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

ALC-210.4電子天平（德國(guó)賽多利斯股份公司提供）；MODEL868型數(shù)字式酸度計(jì)（美國(guó)Thermo公司提供）；HZQ-C空氣浴振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司提供）；JY 92-Ⅱ超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝科器研究所提供）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司提供）；UV-2600紫外可見分光光度計(jì)（尤尼克（上海）儀器有限公司提供）；SHP-1500型生化培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供）；BCN-1360B型生物潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司提供）；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠提供）；PICO17高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司提供）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床150 r／min培養(yǎng)16 h，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中3 500 r／min離心5 min，傾去上清液，再用基本培養(yǎng)基反復(fù)洗滌3次，最后其使懸浮于基本培養(yǎng)基中制成菌懸液，保證菌懸液中細(xì)菌濃度約為1×109個(gè)／m L。

按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制液體培養(yǎng)基，考察不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株降解Poly（3 HB-co-4 HB）的影響。

1.5 酶活力測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液以12 000 r／min離心5 min，取上清液（粗酶液），以Poly（3 HB-co-4 HB）乳化液為底物，分光光度法測(cè)定Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力。取3 m L Poly（3HB-co-4HB）乳化液加1 m L粗酶液，置于50℃恒溫水浴中保溫30 min后，630 nm測(cè)定吸光值變化。以滅活酶液做空白對(duì)照。依照酶活單位定義（50℃條件下，每分鐘引起光吸收降低0.001（A630 nm）單位所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）［7－8］）進(jìn)行酶活力測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響

菌懸液以1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種到100 m L的p H值為7.3的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，150 r／min搖床振蕩培養(yǎng)不同時(shí)間?？疾炫囵B(yǎng)時(shí)間對(duì)降解酶活力的影響，如圖1所示。

由圖1可看出，菌株產(chǎn)酶能力隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，呈上升趨勢(shì)。前12 h增加較為緩慢，這應(yīng)該是菌株的調(diào)整和適應(yīng)階段；培養(yǎng)時(shí)間為12～28 h時(shí)酶活力迅速增加，應(yīng)該是菌株處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，菌體迅速增長(zhǎng)，狀態(tài)最佳，產(chǎn)酶能力增加顯著；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于28 h之后酶活力變化并不明顯，這是由于菌株生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期的結(jié)果。綜上所述，初步確定培養(yǎng)時(shí)間為28 h。

2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響

菌懸液以1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種到100 m L的p H值為7.3的發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 r／min搖床振蕩培養(yǎng)28 h?？疾炫囵B(yǎng)溫度對(duì)降解酶活力的影響，如圖2所示。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株的Poly（3 HB-co-4 HB）降解酶活力的影響Fig.1 Effect of cultivation time on Poly（3 HB-co-4 HB）degrading enzyme activity of the strain

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響Fig.2 Effect of cultivation temperature on Poly（3HB-co-4HB）degrading enzyme activity of the strain

由圖2可看出，酶活力隨培養(yǎng)溫度的變化先上升后下降，培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)降解酶活力最高，此后提高溫度酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，一般來(lái)說(shuō)溫度對(duì)酶活力的影響具有兩面性，一方面溫度的升高有利于酶活力的提高，另一方面溫度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致酶活力的喪失，綜合考慮確定30℃為最適培養(yǎng)溫度。

2.3 搖床轉(zhuǎn)對(duì)速菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響

菌懸液以1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種到100 m L的p H值為7.3的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)28 h?？疾鞊u床轉(zhuǎn)速對(duì)降解酶活力的影響，如圖3所示。

由圖3可看出，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響并不明顯。因搖床轉(zhuǎn)速某種程度上是培養(yǎng)基溶解氧的體現(xiàn)，因此可推測(cè)實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)搖床轉(zhuǎn)速對(duì)培養(yǎng)基溶解氧影響不大，進(jìn)而對(duì)菌株生長(zhǎng)和降解能力影響不明顯。

2.4 裝液量對(duì)菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響

菌懸液以1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種到p H值為7.3的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150 r／min搖床振蕩培養(yǎng)28 h?？疾?50 m L三角瓶中的培養(yǎng)基裝液量對(duì)降解酶活力的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株的Poly（3 HB-co-4 HB）降解酶活力的影響Fig.3 Effect of shaking revolution on Poly（3HB-co-4HB）degrading enzyme activity

圖4 裝液量對(duì)菌株的Poly（3 HB-co-4 HB）降解酶活力的影響Fig.4 Effect of liquid medium volume on Poly（3HB-co-4HB）degrading enzyme activity

由圖4可看出，裝液量對(duì)酶活力有影響，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，裝液量也是培養(yǎng)基溶解氧的體現(xiàn)，由圖4可見培養(yǎng)基裝液量對(duì)溶解氧影響比較明顯，綜合考慮選定培養(yǎng)基裝液量為120 m L。

2.5 培養(yǎng)基初始p H值對(duì)菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響

菌懸液以1%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接種到120 m L的不同p H值的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150 r／min搖床振蕩培養(yǎng)28 h?？疾炫囵B(yǎng)基初始p H值對(duì)降解酶活力的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可看出，酶活力隨培養(yǎng)基初始p H值的增加先上升后下降，p H值為7.3時(shí)酶活力最高，其原因在于p H值影響微生物的代謝以及酶活力，過(guò)高或過(guò)低都不利于微生物的生長(zhǎng)代謝，而且也會(huì)影響到降解酶的活力，因此確定培養(yǎng)基初始p H值為7.3。

2.6 接種量對(duì)菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響

菌懸液以不同接種量接種到p H值為7.3的120 m L發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃，150 r／min搖床振蕩培養(yǎng)28 h?？疾旖臃N量對(duì)降解酶活力的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖5 培養(yǎng)基初始p H值對(duì)菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響Fig.5 Effect of initial p H on Poly（3HB-co-4HB）degrading enzyme activity

由圖6可看出，試驗(yàn)范圍內(nèi)接種量對(duì)酶活力的影響并不明顯，但接種量為1.5%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)酶活力相對(duì)較高。

2.7 正交試驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。實(shí)驗(yàn)的因素和水平如表1所示。

圖6 接種量對(duì)菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影響Fig.6 Effect of inoculation content on Poly（3 HB-co-4 HB）degrading enzyme activity

表1 因素與水平Tab.1 Factors and the levels

表2 正交試驗(yàn)直觀分析Tab.2 Direct analysis of orthogonal test

正交試驗(yàn)的直觀分析如表2所示。K n表示以n水平試驗(yàn)的結(jié)果的均值。R表示因素極差，即K1，K2，K3中最大值與最小值之差。 從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為A1B2C2D2，即培養(yǎng)時(shí)間為28 h，初始p H值為7.3，裝液量為120 m L，接種量為1.5%（體積分?jǐn)?shù)）。根據(jù)表中極差值大小，排列出影響試驗(yàn)的因素的主次順序：C（裝液量）＞D（接種量）＞B（初始p H值）＞A（培養(yǎng)時(shí)間）。

正交試驗(yàn)的方差分析如表3所示。

通過(guò)表3的方差分析再次證明，裝液量對(duì)結(jié)果影響最大，其他影響因素與之相比影響較小。

綜上所述，確定了門多薩假單胞菌DS04-T菌株對(duì)Poly（3 HB-co-4 HB）的最佳產(chǎn)酶條件：培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為28 h，培養(yǎng)基初始p H值為7.3，搖床轉(zhuǎn)速為150 r／min，培養(yǎng)基裝液量為120 m L（250 m L三角瓶），接種量為1.5%（體積分?jǐn)?shù)）。在此優(yōu)化條件下菌株產(chǎn)生的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力可達(dá)（26.2±0.7）U·m L－1。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

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Degradation of Poly（3HB-co-4HB）bypseudomonasmendocinaDS04-T

LI Lin-lin，GAO Jia，YANG Xiang-hua，WANG Zhan-yong
（School of Environmental and Biological Engineering，Liaoning Shihua University，F(xiàn)ushun Liaoning 113001，China）

The degradation of Poly（3HB-co-4HB）bypseudomonasmendocinaDS04-T was studied.Poly（3HB-co-4HB）was used as the sole carbon source of culture medium.The influence of cultivation time，cultivation temperature，shaking revolution，liquid medium volume，initial p H and inoculation content were studied.Combining single factor test and orthogonal test，the optimal degrading enzyme production conditions were chosen as follows：cultivation time is 28 h，cultivation temperature is 30℃，shaking revolution is 150 r／min，initial p H is 7.3，culture medium volume is 120 m L and inoculation content is 1.5%（V／V）.Under the optimized condition，the degradation enzyme activity reaches（26.2±0.7）U·mL－1.

pseudomonasmendocina；Poly（3HB-co-4HB）；degradation；enzyme activity

Q93

A

1008-1542（2012）05-0459-05

2012-03-05；

2012-06-11；責(zé)任編輯：王海云

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31100099）；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（L2011060）；遼寧石油化工大學(xué)科學(xué)基金項(xiàng)目（2011XJJ-025）

李琳琳（1988-），女，山東濟(jì)南人，碩士研究生，主要從事生物化工方面的研究。

王戰(zhàn)勇。E-mail：wangzy125＠gmail.com