郭志華，胡婷婷，單玲玲

(宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，安徽宿州，234000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引發(fā)食源性疾病的常見(jiàn)致病菌，廣泛存在于空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中，對(duì)食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅［1］。

生物被膜是指細(xì)菌附著在生物的或非生物的接觸面生長(zhǎng)，分泌多糖、蛋白質(zhì)等多聚化合物構(gòu)成胞外基質(zhì)，將其自身包裹其中而形成的大量微生物聚集體［2］。生物被膜中的細(xì)菌，尤其是處于深層的細(xì)菌，生物化學(xué)特性和形態(tài)結(jié)構(gòu)均與浮游(planktonic)細(xì)菌不同，增殖和生長(zhǎng)緩慢，對(duì)各種化學(xué)藥物(包括殺菌劑)的耐受性更高［3］。被膜態(tài)的金黃色葡萄球菌具有普遍存在、難發(fā)現(xiàn)和難去除等特點(diǎn)，其抗藥性遠(yuǎn)高于浮游態(tài)的金黃色葡萄球菌。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)指出，人類細(xì)菌性感染約有65%是由生物被膜引起的［4］。因此食品工業(yè)中生物被膜的形成對(duì)食品安全的威脅是不容忽視的，而當(dāng)前對(duì)它的研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，食品工業(yè)領(lǐng)域涉及較少。

乙二胺四乙酸(EDTA)，是人工合成螯合劑，能和許多陽(yáng)離子在一起形成復(fù)合物，在食品行業(yè)被廣泛用作穩(wěn)定劑和螯合劑，它具有抑菌作用、限制生長(zhǎng)必需的陽(yáng)離子、破壞細(xì)菌細(xì)胞膜中的二價(jià)配合物等功能，可作為防腐劑使用。然而關(guān)于EDTA在細(xì)菌生物被膜中的影響的研究還很少，大部分的研究集中在EDTA作為抗菌劑防止致病菌污染導(dǎo)尿管。這些研究用的是高濃度的EDTA，通過(guò)抑制生長(zhǎng)來(lái)抑制生物被膜的形成，或通過(guò)EDTA的螯合特性的殺菌效果根除成熟的生物被膜［5］。

本研究報(bào)道低濃度的EDTA可抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，對(duì)低濃度EDTA在食品加工過(guò)程中單獨(dú)或和其它化學(xué)物質(zhì)結(jié)合使用，防止金黃色葡萄球菌生物被膜的形成提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料儀器

1.1.1 菌種及培養(yǎng)

菌株:金黃色葡萄球菌，購(gòu)于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)。

培養(yǎng)基:胰蛋白胨大豆肉湯(TSB:青島高科海博生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2 主要試劑

EDTA(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)化學(xué)純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MULTISKAN GO酶標(biāo)儀，美國(guó) Thermo;BBSSDC-A超凈工作臺(tái);AL204分析天平;SHP-250型生化培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微孔板法分析生物被膜的形成

微孔板上生物被膜形成定量分析方法見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。無(wú)菌的96孔PVC微孔板每孔中加入100 μL的TSB培養(yǎng)基，并接入10 μL過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液，蓋上蓋子，37℃培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)結(jié)束，移出培養(yǎng)液，微孔板用蒸餾水洗滌3次，去除結(jié)合松散的浮游細(xì)菌，吸附緊密的細(xì)菌細(xì)胞用100 μL的甲醇固定15 min，移除甲醇，微孔板室溫晾干，每孔加入100 μL 1%的結(jié)晶紫溶液，在室溫中染色5 min，移除剩余的染液，并用蒸餾水沖洗板子直到滴水無(wú)色為止。隨后，微孔板在37℃孵育30 min，徹底干燥之后，加入200 μL 33%(體積比)的冰乙酸溶解吸附的細(xì)胞，從每個(gè)孔中吸出100 μL到新的微孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm處的吸光度值(OD)。所有的生物被膜的檢測(cè)均平行進(jìn)行3次，每孔讀取3次讀數(shù)，并計(jì)算相應(yīng)實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差。

1.2.2 EDTA影響生物被膜形成的實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 EDTA濃度的影響

用無(wú)菌的EDTA制作原始溶液(100 mmol/L，pH 7.0)。在轉(zhuǎn)接的開(kāi)始，將EDTA加入到TSB培養(yǎng)基中，EDTA 最終濃度分別為 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mmol/L，用來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè) EDTA 濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響。

1.2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間的影響

在不同的培養(yǎng)期額外加入EDTA，評(píng)價(jià)EDTA加入時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響。

準(zhǔn)備有EDTA和無(wú)EDTA的TSB培養(yǎng)基，“階段轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)”評(píng)價(jià)EDTA在生物被膜形成不同階段的作用。無(wú)菌的96孔PVC微孔板孔中加入100 μL有EDTA和無(wú)EDTA的TSB培養(yǎng)基，并接入10 μL過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮菌液，蓋上蓋子，37℃培養(yǎng)16 h(階段1)，去除孔中浮游的細(xì)菌，每孔清洗3遍，加入100 μL添加EDTA和沒(méi)EDTA的TSB培養(yǎng)基，接著培養(yǎng)32 h(階段2)，經(jīng)過(guò)共48 h的培養(yǎng)，檢測(cè)生物被膜。

此外，本試驗(yàn)做了在有EDTA和無(wú)EDTA的TSB培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.2.3 金屬離子的影響

為研究在金屬螯合劑EDTA與二價(jià)金屬陽(yáng)離子相互作用對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響，在TSB 中分別加入 Mg2+、Fe2+、Ba2+、Ca2+，接種金黃色葡萄球菌，培養(yǎng)36h后測(cè)定生物被膜情況。

1.2.2.4 EDTA消除成熟的生物被膜的研究

在不含EDTA的TSB培養(yǎng)基中接入新鮮金黃色葡萄球菌，PVC96微孔板上37℃培養(yǎng)36 h生成生物被膜。去除培養(yǎng)液，清洗3遍，去除松散的菌體，每孔加入含有不同濃度EDTA的PBS溶液，37℃培養(yǎng)36 h，測(cè)生物被膜情況。

1.2.2.5 聚集實(shí)驗(yàn)［7］

聚集實(shí)驗(yàn)在試管中進(jìn)行，金黃色葡萄球菌接種在5 mL添加EDTA和無(wú)EDTA的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)36h，培養(yǎng)結(jié)束后小心吸取上層溶液，測(cè)OD600，其余的經(jīng)渦輪振蕩后，取菌懸液，測(cè)OD600。

2 結(jié)果與分析

2.1 EDTA濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

EDTA對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響由圖1。隨著EDTA濃度的增加，生物被膜的生成量逐漸下降，到0.2 mmol/L時(shí)下降量基本趨于穩(wěn)定，EDTA對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成最小抑制濃度為0.2 mmol/L，抑制率可達(dá)32%。0.2 mmol/L EDTA抑制生物被膜形成的能力與無(wú)EDTA相比存在顯著差異(P＜0.01)，說(shuō)明低濃度EDTA能夠抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，抑制作用與EDTA添加濃度有關(guān)［5］。

圖1 EDTA濃度對(duì)生物被膜的影響

2.2 EDTA加入時(shí)間時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

為確定EDTA影響生物被膜生成的哪個(gè)階段，在整個(gè)生長(zhǎng)階段的0、5、10、15、20、25、30、35、40 h 分別加入EDTA，使其最終濃度為0.2 mmol/L，結(jié)果見(jiàn)圖2。表明在零時(shí)間加入EDTA對(duì)生物被膜形成抑制作用最好。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，加入EDTA對(duì)生物被膜形成的影響就越小。因此推斷EDTA只影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的早期階段。這一假設(shè)被“階段轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)”證實(shí)?！半A段轉(zhuǎn)變實(shí)驗(yàn)”第1階段和第2階段相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，EDTA在早期的出現(xiàn)會(huì)抑制生物被膜的形成，在第2階段加入EDTA不能影響生物被膜的形成。這些數(shù)據(jù)表明，EDTA只能影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的早期階段。生物被膜的形成可分為3步:細(xì)菌在接觸表面的吸附、微菌落的發(fā)育、包被多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物的成熟被膜的形成，不同階段具有不同的生理特性［8］。本研究的結(jié)果表明，EDTA可能從開(kāi)始就影響金黃色葡萄球菌在接觸面的吸附，從而抑制生物被膜的形成。

2.3 EDTA對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

圖2 EDTA加入時(shí)間對(duì)生物被膜的影響

為了進(jìn)一步研究EDTA抑制生物被膜的作用機(jī)理，我們把金黃色葡萄球菌在有或無(wú)EDTA的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔3 h測(cè)OD600，獲得的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。沒(méi)有EDTA時(shí)金黃色葡萄球菌由接種到33 h細(xì)胞數(shù)量增加到最高值，33 h后細(xì)胞的生長(zhǎng)處于衰亡期，有一部分菌體就開(kāi)始死亡。而加入EDTA后，菌體的生長(zhǎng)受到抑制。這表明生物被膜的抑制可能與生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)。EDTA在濃度為0.2 mmol/L時(shí)，不僅可抑制生物被膜的形成，而且具有抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的作用。劉劍等人在研究EDTA對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)抑制和抗黏附作用研究中發(fā)現(xiàn)，EDTA對(duì)變異鏈球菌的最低抑菌濃度為0.5 mg/mL，約為 1.71 mmol/L［9］。

圖3 金黃色葡萄球菌在有或無(wú)EDTA的生長(zhǎng)曲線

2.4 金屬離子與EDTA混合對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的影響

不同金屬離子與EDTA混合對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形成有不同的影響(圖3)，EDTA-Fe、EDTACa、EDTA-Mg混合后生物被膜的量有一定的增加，與無(wú)EDTA相比，有顯著性差異(P＜0.01)，說(shuō)明Fe2+、Ca2+、Mg2+可以阻斷EDTA抑制生物被膜的效應(yīng)。但是EDTA-Ba混合后生物被膜量變化不大，與無(wú)EDTA相比，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，Ba2+不能完全阻斷EDTA抑制生物被膜生成。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，Ehud Banin［10］研究不同二價(jià)金屬離子對(duì)EDTA抑制綠膿桿菌生物被膜形成的效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，Ba2+沒(méi)有影響EDTA的抑制效應(yīng);Mg2+沒(méi)有完全阻斷EDTA的抑制效應(yīng);但Fe2+、Ca2+可完全阻斷EDTA的抑制效應(yīng)。對(duì)于綠膿桿菌，加入Ca2+，可增加生物被膜的粘結(jié)性，減少菌的分散。Chen［11］等認(rèn)為，F(xiàn)e2+產(chǎn)生的靜電作用有助于生物被膜的粘性，F(xiàn)e2+和Ca2+可穩(wěn)定生物被膜。

圖4 金屬離子與EDTA混合對(duì)生物被膜的影響

2.5 EDTA消除成熟的生物被膜的研究

為了研究EDTA對(duì)已生長(zhǎng)成熟的金黃色葡糖球菌生物被膜是否有影響，把EDTA加入金黃色葡糖球菌已成熟的生物被膜溶液中培養(yǎng)36 h，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，每個(gè)EDTA濃度與無(wú)EDTA之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，EDTA不能破壞已經(jīng)形成的生物被膜，即使是高濃度的EDTA也不能影響成熟的細(xì)胞被膜數(shù)量。

圖5 EDTA對(duì)成熟生物被膜的影響

2.6 聚集實(shí)驗(yàn)

因?yàn)樯锉荒な窃诩?xì)胞-表面和細(xì)胞-細(xì)胞之間形成的，因此要評(píng)估EDTA對(duì)這兩種相互作用的影響。上述的研究是在PVC微孔板中進(jìn)行的，以了解EDTA在細(xì)胞-表面相互作用的影響。通過(guò)研究，EDTA可抑制金黃色葡萄球菌在PVC上生物被膜的形成。當(dāng)培養(yǎng)基中沒(méi)有EDTA時(shí)，聚集的百分比為86%;培養(yǎng)基中有0.2 mmol/L EDTA時(shí)，聚集百分?jǐn)?shù)降到30%。聚集的形成說(shuō)明細(xì)胞之間有粘附作用，加入EDTA后減少聚集的形成，說(shuō)明EDTA能抑制細(xì)胞之間的粘附作用。

3 討論

相較于其他細(xì)菌，能夠形成生物被膜的細(xì)菌更耐消毒劑和清洗。因此，抑制生物被膜的形成和根除生物被膜具有特殊意義。實(shí)驗(yàn)中研究了低濃度EDTA對(duì)金黃色葡萄球菌在PVC上產(chǎn)生生物被膜的影響。

低濃度的EDTA可抑制金黃色葡萄球菌產(chǎn)生生物被膜，而且是在生物被膜形成的早期就可形成影響。EDTA可作食品添加劑加入食品中用來(lái)防腐，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)使用的濃度為0.075 g/kg，約0.668 mmol/L。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，0.2 mmol/L的EDTA就可以抑制生物被膜的形成，遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可減少原料浪費(fèi)。

實(shí)驗(yàn)證明EDTA只影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的早期階段，加入EDTA時(shí)間越早對(duì)金黃色葡萄球菌的生物被膜的形成影響越大。從在加入EDTA和沒(méi)有加入EDTA的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線可以了解，EDTA對(duì)生物被膜的抑制可能與生長(zhǎng)受到抑制有關(guān)。后面的聚集實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了這一觀點(diǎn)。

因?yàn)镋DTA作為一個(gè)螯合劑，可螯合金屬離子如鎂、鈣、鋇和鐵等。一開(kāi)始假設(shè)的生物膜抑制是由于EDTA螯合。然而，實(shí)驗(yàn)表明除去了Fe2+、Ca2+可阻斷EDTA對(duì)生物膜形成的抑制作用，證明EDTA對(duì)生物膜抑制作用，并非由于螯合性能。

聚集的形成說(shuō)明細(xì)胞之間有粘附作用，加入EDTA后減少聚集的形成，說(shuō)明EDTA能抑制細(xì)胞之間的粘附作用，可減少金黃色葡萄球菌的生物被膜形成，對(duì)食品生產(chǎn)及生活清潔中的抑制生物被膜的行程及易于消除有積極意義。

EDTA對(duì)金黃葡萄球菌生物被膜有抑制或分散的作用，因此，在食品工業(yè)中合理使用EDTA，可有效地防止金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。

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