楊成，張濤，江波，繆銘，沐萬孟，馬亞君，張薇

(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

谷氨酰胺酶 (glutaminase，EC 3.5.1.2，GA)是一種催化L-谷氨酰胺(L-Gln)水解成L-谷氨酸和氨的酰胺酶，廣泛分布于動物體內及細菌、真菌等微生物中［1-2］。谷氨酰胺酶是食品工業(yè)中的一種重要酶制劑，是一種既有水解活力又有轉移活力的多功能酶。一些微生物來源的谷氨酰胺酶因具有轉移活力，可以催化谷氨酰胺的γ-谷氨?；D移反應，制備一種功能性食品添加劑——茶氨酸。

茶氨酸(L-theanine)是茶葉特有的一種氨基酸，是茶葉中有效的呈味物質，具有抗腫瘤、降血壓、提高學習能力、抗疲勞、神經保護和提升免疫力等多種生理功能［2］。目前，微生物發(fā)酵法制備茶氨酸已成為國內外研究熱點，其主要應用的酶制劑有谷氨酰轉肽酶 (γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)和谷氨酰胺酶。其中，有關于谷氨酰轉肽酶的應用，國內已有較多報道，主要有賈曉鶴等人［3］和王春暉等人［4］利用重組谷氨酰轉肽酶和帥玉英等人［5］自主篩選出的GGT高產菌株制備谷氨酰轉肽酶催化合成茶氨酸。谷氨酰胺酶催化合成茶氨酸的報道主要有王春暉等人［4］報道的利用硝基還原假單胞菌細胞生物合成茶氨酸，但國內有關于谷氨酰胺酶酶法制備茶氨酸以及谷氨酰胺酶的分離純化和酶學性質的報道卻較為少見。

本文主要研究硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)SK16.004所產的谷氨酰胺酶的分離純化和酶學性質，為進一步研究酶的催化機制及其在茶氨酸酶法制備中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種:硝基還原假單胞菌(Pseudomonas nitroreducens)SK16.004，江南大學食品科學與技術國家重點實驗室篩選保藏。

主要試劑:L-谷氨酸-γ-單羥肟酸，Sigma公司;Hiprep DEAE FF 16/10，美國 GE公司;Superdex 75 10/300 GL，美國GE公司;考馬斯亮藍R250，上海化學試劑公司進口分裝;(NH4)2SO4，上?；瘜W試劑公司;其他化學試劑均為分析純。

斜面培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏3，NaCl 5，瓊脂15，pH 7.0，于121℃，0.08 MPa 下滅菌 20 min。

種子培養(yǎng)基 (g/L):蛋白胨10，牛肉浸膏3，NaCl 5，pH 7.0，于121℃，0.08 MPa 下滅菌 20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L):蔗糖5，谷氨酸鈉6，酵母膏1，MgSO4·7H2O 0.7，K2HPO40.5，KH2PO40.5，EDTA-Fe 0.1，pH 7.0，于121℃，0.08 MPa 下滅菌 20 min。

1.2 實驗儀器

?kta purifier 100蛋白質純化系統(tǒng)，GE公司;10 kDa截留量超濾膜，Millipore公司;混合纖維樹脂微孔濾膜(0.45 μm)，上海新亞凈化儀器廠;DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精密實驗設備有限公司;721E型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)及酶的提取

取2環(huán)斜面種子接入到種子培養(yǎng)基中，于30℃，200 r/min下培養(yǎng)14 h后接入裝液量為10%的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為3%，于同樣條件下培養(yǎng)21 h。發(fā)酵結束后培養(yǎng)基在4℃，10 000 r/min離心10 min，得到濕菌體，將菌體用pH 7.0，10 mmol/L的K3PO4緩沖液重懸后超聲破碎30 min(工作1s，暫停2s)，于10 000 r/min，4℃離心10 min即得粗酶液。

向粗酶液中加入70%(NH4)2SO4，于4℃靜置4 h，9 000 r/min離心除去雜蛋白，再向溶液中繼續(xù)加入(NH4)2SO4至濃度為80%，4℃靜置12 h后離心得到酶蛋白沉淀。沉淀用少量pH 7.5，10 mmol/L的K3PO4緩沖液溶解后透析24 h，以除去其中的透析好的酶液通過DEAE-fast flow離子交換柱和Superdex 75凝膠柱進行分離純化，采用?kta蛋白純化系統(tǒng)進行檢測，最終得到目的蛋白。多次重復純化步驟，將收集到的純酶液進行冷凍干燥，用于測定酶學性質。

1.3.2 Hiprep DEAE-FF 16/10離子交換層析

Hiprep DEAE-FF 16/10弱陰離子交換柱 (φ1.6 cm×10 cm)用起始緩沖液(10 mmol/L，pH7.5的K3PO4緩沖液)平衡10個柱體積后，上樣1 mL，沖洗2個柱體積后，用含有0～1 mol/L NaCl的起始緩沖液進行線性梯度洗脫5個柱體積，流速保持在2 mL/min。二次層析時，使用線性洗脫5個柱體積，其他條件同上。

1.3.3 Superdex 75 10/300 GL凝膠過濾層析

Superdex 75 10/300 GL凝膠柱用含0.15 mol/L NaCl的10 mmol/L，pH 7.0的磷酸鉀緩沖溶液平衡5個柱體積。濃縮DEAE活性峰后，上樣0.5 mL，用同樣的溶液洗脫1.5個柱體積，流速為0.5 mL/min。

1.3.4 SDS-PAGE電泳

分離膠和濃縮膠的濃度分別為12%和4%，操作電流為20 mA，上樣量10 μL，電泳完畢后，用12%的三氯乙酸固定，考馬斯亮藍染色2 h后脫色。

1.3.5 酶活測定方法

比色法測定酶活［6］:根據(jù)谷氨酰胺酶可以將谷氨?；D移到鹽酸羥胺上得到L-谷氨酸-γ-單羥肟酸的原理［10］，在 1 mL，100 mmol/L 咪唑-HCl(pH 9.0)緩沖溶液的酶活測定體系中，含35 mmol/L的谷氨酰胺 (L-Gln)和150 mmol/L的鹽酸羥胺，加入150 μL酶液，于30℃下反應15 min，加入2 mL終止液(10%FeCl3∶24% 三氯乙酸∶6 mol/L HCl∶水 =8∶2∶1∶13)，測定540 nm下的吸光度。酶活力單位定義為1 min生成1 μmol L-谷氨酸-γ-單羥肟酸所需要的酶量。

1.3.6 蛋白質濃度的測定

采用Lowry法［7］，以牛血清蛋白為標準。

1.3.7 GA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

將酶液分別在 30、37、40、50、55、60、70℃，pH 9.0的條件下進行酶反應，測定酶活，以最高酶活為100%，得到不同溫度下的相對酶活，確定谷氨酰胺酶的最適反應溫度。

將酶液分別在 30、37、40、50、55、60、70℃下保存4 h，每隔一定時間取樣，在最適溫度，pH 9.0的條件下測定殘余酶活，以未經處理的酶液的酶活為100%，得到相對酶活并作圖。

1.3.8 GA的最適pH及pH穩(wěn)定性

將酶液分別用不同pH緩沖液調至pH 5.0～11.0，在55℃下進行酶反應，測定酶活，以最適pH下的酶活為100%，確定谷氨酰胺酶的最適反應pH。

將酶液分別在pH 5.0～11.0的緩沖液中保存12 h，在55℃、pH 9.0條件下測定酶活，以最高酶活為100%，得到相對酶活并作圖。

1.3.9 金屬離子對GA酶活的影響

酶液在含5 mmol/L EDTA的K3PO4緩沖液中透析12 h，除去金屬離子后于不含EDTA的緩沖液中4℃透析24 h除去殘留EDTA。在處理后的酶液中分別加入不同的金屬離子 (Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Fe2+、Fe3+，離子終濃度分別為0.2 mmol/L和2 mmol/L)，并于4℃，pH 9.0條件下保溫1 h后測定殘余酶活，以不添加金屬離子或化合物的酶液活力為100%。

1.3.10 GA的底物專一性

實驗采用多種γ-谷氨酰基供體［6］代替酶活測定方法中的L-Gln，其他反應條件不變，測定酶活，考察谷氨酰胺酶對不同谷氨酰供體的親和力，以L-Gln為供體時的酶活力為100%。

1.3.11 GA酶反應動力學常數(shù)的測定

考察L-Gln，鹽酸羥胺酶活測定體系中，底物LGln的反應動力學常數(shù)。分別配制0.5～25 mmol/L不同濃度的底物溶液，測定酶活，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，計算GA的米氏常數(shù)Km和最大反應速度Vmax。

2 結果與討論

2.1 谷氨酰胺酶的分離純化

2.1.1 硫酸銨分級沉淀結果

由圖1可以看出，(NH4)2SO4飽和度達到80%時，沉淀級分的比酶活最高，因此先用70%飽和度的(NH4)2SO4沉淀除去大部分雜蛋白，然后增加(NH4)2SO4的飽和度到80%，收集沉淀級分。

圖1 硫酸銨分級沉淀結果

2.1.2 DEAE離子交換層析

據(jù)文獻報道［6］，谷氨酰胺酶的等電點一般在5.5～7.5左右，pH穩(wěn)定范圍在5.5～8.0，因此選擇弱陰離子交換柱DEAE-Sepharose fast flow對GA進行分離純化。圖2顯示，酶活主要集中在洗脫體積為75～93 mL的峰中，GA主要在0.3～0.5 mol/L NaCl范圍內被洗脫下來。為進一步純化，將活性峰濃縮后再次上樣。

圖2 GA的DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析圖

由圖3可以看出，活性峰中的酶蛋白，進一步洗脫后得到4個蛋白峰，分別測定酶活后，發(fā)現(xiàn)酶蛋白主要集中于0.3～0.4 mol/L的洗脫梯度中，其他3個峰未測到酶活。經兩次離子交換層析后，除去大量的雜蛋白，酶被純化了2.6倍，回收率為19.53%。

圖3 GA的二次DEAE-Sepharose Fast Flow柱層析圖

2.1.3 凝膠過濾層析

據(jù)文獻報道［6］，微生物谷氨酰胺酶的分子質量范圍多在25～67 ku，因此實驗采用排阻范圍在3～70 ku的Superdex 75 10/300 GL凝膠柱，在洗脫體積為9～11 mL處得到單一活性峰，通過酶活檢測收集活性峰，回收率為9.33%，純化倍數(shù)為4.14倍。由圖4出峰結果，可估計目的蛋白的分子質量大約在41 kDa左右。

圖4 GA的Superdex 75 10/300 GL凝膠層析色譜圖

2.1.4 純化各步驟酶活回收率

由表1可知，粗酶液經過各步純化后，比酶活提高到0.949 U/mg，純化倍數(shù)達到4.14倍。

表1 GA的分離純化結果

2.1.5 SDS-PAGE電泳

將分離純化后的組分分別進行SDS-PAGE電泳，結果如圖5所示。純化后的樣品呈單一條帶，達到電泳純度。根據(jù)標準分子質量計算，該酶的分子質量約為41ku，與凝膠柱分析結果一致。

2.2 GA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

圖5 不同純化階段酶活組分SDS-PAGE電泳圖

由圖6可知，該酶的最適反應溫度在55℃左右，在37～60℃內保持較高的活性，酶的相對活力保持在70%以上。其最適溫度與Weingand-Ziadé等人［8］報道的50℃和 Durá等人［9］報道的 40℃較為接近(表4)。

圖6 GA的最適反應溫度

由圖7可知，GA具有較強的熱穩(wěn)定性，在30～55℃保溫4 h后，酶活保持在80%以上，基本沒有損失;而在溫度高于60℃，保溫0.5 h時，酶活損失嚴重;至70℃時，酶活下降了近90%。

圖7 GA的溫度穩(wěn)定性

通過對GA最適溫度和溫度穩(wěn)定性的研究，有助于確定制備茶氨酸的酶反應條件。在茶氨酸的制備過程中可以通過單因素實驗，選擇30℃，40℃，50℃及55℃進行最適反應溫度的研究。

2.3 GA的最適pH值及pH穩(wěn)定性

由圖8可知，酶反應的最適pH為9.0，在pH為5.0～11.0時，酶活保持在80%以上，具有廣泛的最適pH值范圍，其最適 pH與 Tachiki等人［6］報道的pH 9.0和Durá 等人［9］報道的 pH 8.5 接近，綜合其他研究結果(表4)可知，微生物來源的GA的最適pH 多偏堿性［11］。

圖8 GA最適反應pH

由圖9可知，GA在pH 5.0～11.0內酶活基本保持穩(wěn)定，其耐酸耐堿能力比Tachiki等人［6］報道的pH 5.5～8.0要高。

圖9 GA的pH穩(wěn)定性

根據(jù)上述實驗可證明該酶在堿性條件下活力高且保持穩(wěn)定，適宜進行轉移反應，制備茶氨酸。本實驗室同樣測定出，利用GA生產茶氨酸的反應體系最適pH為9.5與該酶的最適pH接近。

2.4 金屬離子對GA酶活的影響

金屬離子的加入一方面可以改變溶液的離子強度，對蛋白質鏈上氨基酸的電離造成影響，從而改變蛋白質的高級結構，另一方面許多金屬離子是某些復合蛋白酶的輔助因子，會對酶的活性位點產生影響，所以金屬離子的加入會對酶活產生影響(見表2)。

由表2可知，在10種金屬離子中，不同濃度的Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ba2+、Ca2+對 GA 的酶活影響不明顯，Cu2+、Mg2+、Fe2+可以提高 GA 轉移活力，且隨著濃度的增高，Cu2+對促進酶活提高作用最大，與Tachiki等人的研究結果相似［6］。EDTA會輕微抑制酶活，而添加Fe3+會降低34.38%的轉移活力。

表2 金屬離子對酶活的影響

2.5 GA的底物專一性

多數(shù)研究結果顯示GA具有很強的底物專一性，L-Gln是GA催化的最好底物。此外，部分微生物來源的微生物也可以催化D-Gln、L-天冬酰胺和D-天冬酰胺的水解［1］。因此本文對硝基還原假單胞菌所產GA的底物專一性進行了研究結果見表3。

表3 谷氨酰胺酶的底物專一性

由表3可知，GA對L-Gln的親和力最強，具有很好的專一性。對 γ-谷氨酰-對硝基苯胺 (含芳香基團)的親和力較弱，分析原因可能是空間位阻的大小影響酶與底物的親和力。而GA與谷氨酸鈉、谷氨酸、天冬酰胺的親和力極弱。結果表明，GA主要具備谷氨酰基的轉移活力，而對其他氨基酸基團或天冬酰基的轉移活性極弱。該結果與Tachiki等人［6］的研究結果不同，GA的底物專一性更好，分析原因可能是酶的空間結構與特殊位點存在差異，從而產生不同的立體異構專一性。

由于GA對L-Gln的高度專一性，可以初步確定將L-Gln作為茶氨酸制備過程中最適的谷氨?；w。

2.6 GA酶反應動力學常數(shù)的測定

酶促反應的動力學是研究酶促反應的速度以及影響速度的各種因素的科學。動力學研究既可以為酶的機理研究提供實驗數(shù)據(jù)，又可以指導酶在生產中的應用，以最大限度地發(fā)揮酶的催化作用。Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質、酶所催化的底物和酶促反應條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關，與酶的濃度無關。

采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖，繪制酶作用于L-Gln的動力學曲線，以圖10中橫坐標的截距為-1/Km，縱坐標的截距為1/Vmax，根據(jù)回歸方程計算，得到谷氨酰胺酶對底物 (L-Gln)的Km值為0.72 mmol/L，對底物 (L-Gln)的 Vmax為 0.55 μmol/(min·mL)。表4列出了部分不同來源的GA的性質比較。

圖10 GA的Lineweaver-Burk圖

表4 不同來源的谷氨酰胺酶的性質比較［11－12］

由表4可知，不同菌種谷氨酰胺酶的性質有所不同，其中P.Nitroreducens SK16.004與E.coli所產GA的相對分子量和最適pH相差較大，但對于反應底物Gln的Km值較為接近［12］。來自假單胞菌屬不同菌株所產的GA，雖最適pH與相對分子量較為接近，但在耐熱性和Km值上有較大差別［6］。但酵母菌屬的De-baryomyces［9］與乳桿菌屬的 Lactobacillus［10］雖來源不同，但在酶學性質如最適溫度、pH和Km值等多方面具有相似之處。

3 結論

(1)采用DEAE-Sepharose Fast Flow和Superdex 75 10/300 GL凝膠過濾等純化方法，獲得了硝基還原假單胞菌谷氨酰胺酶，純化倍數(shù)為4.14，回收率為9.33%。通過SDS-PAGE電泳檢測純度，得到單一條帶，即純化后樣品達到電泳純，谷氨酰胺酶的相對分子量約為41 ku。

(2)硝基還原假單胞菌SK16.004谷氨酰胺酶轉移酶活的最適溫度為55℃，溫度在37～60℃范圍內時，酶殘余活力在70% 以上。該酶的最適pH為9.0，在pH 5.0～11.0時，轉移酶活保持穩(wěn)定。

(3)在 10 種金屬離子中，Mn2+、Co2+、Ni2+、Zn2+、Ba2+對 GA 的酶活影響不明顯，Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+可以提高GA轉移活力，其中Cu2+對促進酶活提高作用最大。EDTA會輕微抑制酶活，而添加Fe3+會降低34.38%的轉移活力。

(4)GA對不同的底物 γ-谷氨酰-對硝基苯胺(含芳香基團)、谷氨酸鈉、谷氨酸、天冬酰胺的親和力較弱，而對L-Gln的親和力最強，具有很高的底物專一性。

(5)以L-Gln為底物，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖得到 GA的 Km值為0.72 mmol/L，Vmax為0.55 μmol/(min·mL)。

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