李明利, 田巍威, 高躍東, 郭 彥, 黃京飛, 張華堂,*

(1. 中國科學院昆明動物研究所 動物模型與人類疾病機理重點實驗室, 云南 昆明 650223; 2. 中國科學院研究生院, 北京 100049; 3. 西南大學 生物技術學院, 重慶 北碚 400715; 4. 中國科學院昆明生物多樣性大型儀器區(qū)域中心, 云南 昆明 650223; 5. 中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室, 云南 昆明 650223)

樹鼩干擾素家族的基本構成及分子特征分析

李明利1,2, 田巍威1,3, 高躍東4,5, 郭 彥1, 黃京飛4,5, 張華堂1,*

(1.中國科學院昆明動物研究所 動物模型與人類疾病機理重點實驗室,云南 昆明650223; 2.中國科學院研究生院,北京100049; 3.西南大學 生物技術學院,重慶 北碚400715; 4.中國科學院昆明生物多樣性大型儀器區(qū)域中心,云南 昆明650223; 5.中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室,云南 昆明650223)

干擾素(IFN)是在“危險信號”刺激下, 由細胞分泌的具有抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖和免疫調節(jié)等多重作用的糖蛋白家族, 在機體免疫系統(tǒng)中具有重要地位。樹鼩作為多種人類疾病研究模型的前景已受到廣泛關注, 但對其IFN家族的研究尚屬空白。該研究在現有的樹鼩全基因組數據基礎上, 應用大片段核酸序列比對、基因預測等方法, 對樹鼩IFN家族的基本構成和分子特征進行預測和分析。結果顯示, 樹鼩具有I型IFN：α (5個亞型)、β、ω、κ、ε、δ；II型IFN-γ；III型IFN：IFN-λ1、λ2/3, 所編碼的氨基酸序列及蛋白空間結構與其它哺乳動物具有較高的相似性, 但在半胱氨酸位置和N糖基化個數上具有部分差異。該研究以全基因組數據對樹鼩IFN家族信息進行系統(tǒng)挖掘和分析, 為樹鼩IFN的基因克隆以及其在感染免疫學中的作用和機理研究奠定了基礎。

樹鼩; 干擾素; 大片段核酸序列比對; 基因預測

干擾素(interferon, IFN)最初是由Isaacs & Lindenmann(1957)在研究病毒干擾現象時發(fā)現的一類性質待定的“可溶性物質”。直至1980年, Taniguchi et al(1980a; 1980b)首次克隆了人IFN-α和IFN-β全長cDNA, 由此，IFN成為研究最早的一類細胞因子?，F已證明, IFN為多成員家族, 它們普遍存在于脊椎動物中, 是多種類細胞在受到“危險信號”刺激后分泌的糖蛋白。IFN作為機體抵抗病毒感染的第一道防線, 具有抗病毒、抗腫瘤、抑制細胞增殖及免疫調節(jié)等多重作用(Ank et al, 2006; Brand et al, 2005; Kotenko et al, 2003; ?sterlund et al, 2005)。依據基因序列、染色體定位和受體特異性等特點, 可將IFN分為3種類型(Kotenko et al, 2003; Samarajiwa et al, 2009)。I型IFN包括9個亞型, 即α、β、ε、κ、τ、ω、ζ、ν、δ; II型IFN僅有IFN-γ 1種; III型IFN由 IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B)構成。

樹鼩(tree shrew,Tupaia belangeri), 其外形酷似松鼠(Cao et al, 2003), 在進化關系上與靈長類動物較為接近(Novacek, 1992; Waddell et al, 2001)。Walter et al(1996)證實了我國學者早在80年代的發(fā)現(Su et al, 1987), 即樹鼩肝細胞在體內外均能感染人乙型肝炎病毒(HBV), 表明樹鼩可作為模型動物用以研究乙型肝炎病毒致病機理，但是, 目前對樹鼩IFN家族的研究尚屬空白狀態(tài)。闡明樹鼩IFN家族的基本成員及其分子結構-功能關系, 是系統(tǒng)研究IFN在乙型肝炎等病毒性疾病感染過程中免疫功能的前提。因此, 本研究以目前僅有的樹鼩全基因組數據為基礎, 通過基因預測和蛋白質模建等生物信息學方法, 對樹鼩IFN家族的基本構成和分子結構特征進行了系統(tǒng)分析, 為進一步全面深入樹鼩IFN的功能和免疫調節(jié)機理研究奠定基礎。

1 材料方法

1.1 樹鼩基因組及參比IFN基因

樹鼩全基因組序列(BioProject Accession: PRJNA13971)取自NCBI數據庫。這一序列由美國哈佛-麻省理工的博德研究所(Broad Institute of MIT and Harvard)于2006年公布, 覆蓋率為2倍(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/108744176)。用以參比的已克隆各物種IFN基因取自GenBank數據庫, 其錄入號分別為：

I型IFN：人α：NM_024013, NM_000605, NM_ 021068, NM_002169-73, NM_021002, NM_021057, NM_027866-67, NM_004681, NM_006900, NM_ 021268, NM_002175, NM_036676； β：NM_002176；ε: NM_176891；κ: NM_020124；ω: NM_002177。小鼠α：NM_010502-05, NM_206871, NM_0083343, NM_010507,NM_008333,NM_177361,M_177347；β：NM_010510；ε: NM_177348；ζ: NM_197889；κ: NM_199157。大鼠α：NM_001014786, NM_233152；β：NM_019127; 豬α：NM_214393, NM_001130219, NM_001166319, NM_001164860, NM_001164848-49, NM_001195377, NM_001166310, NM_0011130246, NM_001164843, NM_001166318, NM_001164855, NM_001195375；β：NM_001003923；δ：NM_ 001002832；ε: NM_001105310； κ: NM_001164857；ω: NM_ 001130238。牛α：NM_001017411, NM_ 174085, NM_001172040-41；β：NM_174350；τ：NM_001245936；ω: NM_174351。馬α：NM_ 001114537- 38, NM_001099441；β：NM_001099440；ω: NM_001083595。貓NM_001006654。雞NM_205427。

II型IFN:人NM_000619；黑猩猩NM_ 001193665；小鼠NM_213948；大鼠NM_008337；豬NM_1388802；牛NM_174086；馬NM_ 001081949；羊NM_001009803；貓NM_001009873；犬NM_ 001003174。

III型IFN：人NM_172138-40; 小鼠NM_ 001024673, NM_177396; 蝙蝠HQ201955-56; 雞EF587763; 爪蟾FJ581033-36。

1.2 基因預測

以上述樹鼩全基因組和各物種IFN編碼序列為基礎, 采用全基因組在線BLAST(Altschul et al, 1990)及用于大片段序列比對的工具BLASTZ (Schwartz et al, 2000, 2003) 進行序列比對。采用GENSCAN(Burge & Karlin, 1998)預測軟件對樹鼩IFN家族的可能成員進行預測。該基因預測方法的基礎為五階馬爾可夫模型, 同時結合了六聚體頻率以及編碼信號如起始密碼子、TATA框、帽子位點、poly-A等信息預測基因。

1.3 分子特征分析

分別采用DNAMAN(http://www.lynnon.com/)、BLASTP(Altschul et al, 1990)和t_coffee (Notredame et al, 2000)對核酸和氨基酸序列進行分析。內含子-外顯子基因結構模式圖用在線軟件Fancy GENE v1.4(http://host13.bioinfo3.ifom-ieo-campus.it/fancyg ene/)構建。蛋白質信號肽序列采用在線SignalP 3.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測。蛋白質三維結構的模建和分析則通過Discovery studio(Accelrys Software：Discovery Studio 3.1)和PyMOL(http://www.pymol.org/)完成。

2 結果與討論

2.1 基因組數據來源與質量

盡管本研究所采用的基因組數據僅有2倍覆蓋率, 但依據此基因組序列, Ensembl數據庫已預測得到了樹鼩IFN-λ編碼基因(ENSTBET0000005887) (http://asia.ensembl.org/Tupaia_belangeri/Gene/Sum mary?g=ENSTBEG00000005902;r=scaffold_115883: 37536-39087;t=ENSTBET00000005887)。同時，Fox et al(2009)預測得到兩條樹鼩IFN III型基因(具體序列未公布)。2011年10月, Lindblad-Toh et al (2011)使用該2倍覆蓋率樹鼩基因組作為29個哺乳動物之一進行多物種全基因組分析, 得出“所有哺乳動物編碼基因均受共同的DNA(包含啟動子中的保守元件、蛋白編碼序列中的功能元件、轉錄因子靶序列等)調節(jié), 從而增強或減弱編碼基因表達”的結論。此外, 我們利用此數據已成功克隆得到樹鼩IFN-λ2/3的全長cDNA序列(待發(fā)表)。這些結果表明，現有的樹鼩基因組數據為進一步挖掘、分析相關基因奠定了基礎。進一步, 我們將使用華盛頓大學醫(yī)學院的基因組測序中心(Genome Sequencing Center (GSC) at Washington University (WashU) of Medicine)測定的6倍(BioProject Accession: PRJNA20273)(待發(fā)表)和中科院昆明動物研究所測定的70倍覆蓋率樹鼩基因組(待發(fā)表)進行IFN基因挖掘和驗證。

2.2 樹鼩I型IFN的基本構成和結構特征

我們首先對樹鼩I型IFN家族的基本構成進行了預測和分析。結果表明, 在現有的9種I型IFN中, 樹鼩具有較為明確的編碼α、β、ε、κ、ω、δ的6種基因序列(表1)。其中, IFN-α包含5個(α1、α2、α4、α9、α22)亞型, 而δ、ε及α22有2～5條可能的編碼序列(有待進一步證實), 但并未發(fā)現τ、ζ、ν及α3、α5-8、α10-17、α20-21的相應序列。從表1中亦可看出, 已克隆測序的IFN基因, 在各物種中差異較大, 也進一步表明，對包括樹鼩在內的各物種進行IFN研究的空間較大。

為進一步研究樹鼩IFN-α1與其它物種IFN-α1之間的差異, 我們對IFN-α1的氨基酸序列進行了多序列比對(圖1)。與人(Homo sapiens)、小鼠(Mus muculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、馬(Equus caballus)和豬(Sus scrofa)IFN-α1相同, 樹鼩IFN-α1基因可編碼24個氨基酸的信號肽, 表明其同樣為分泌蛋白。根據Zou et al (2007)的報道, I型IFN可以分為含2個半胱氨酸和含4個半胱氨酸兩個亞類。多序列比對分析顯示，樹鼩與人、小鼠、大鼠、豬的IFN-α1均屬于后者。 此外, 所有參與比對的IFN-α1 C末端均具有一個保守的CAWE基序, 表明樹鼩與其它哺乳動物I型IFN的基本特征一致。但是, 樹鼩IFN-α1的第4個半胱氨酸在位置上與人、小鼠、大鼠和豬IFN-α1的有所不同; 樹鼩、牛、馬在人、小鼠、大鼠的第2個半胱氨酸位置上不包含半胱氨酸。 這些都有待進一步的基因克隆和測序加以驗證。牛和馬IFN-α1僅含3個半胱氨酸(圖1), 與斑點叉尾鮰(channel catfish)相同(Robertsen, 2006), 提示IFN-α1在多物種進化速率上存在差異。同時, 這些半胱氨酸是否會配對形成二硫鍵以影響IFN-α1結構和功能；是否有除半胱氨酸之外的其他氨基酸或基序對IFN的結構?功能具有重要作用。這些均值得進一步研究。

我們進一步用Dsicovery Studio對樹鼩的IFN-α1進行了結構模建, 所使用的模板為實驗測定的人IFN-α1三維結構(PDB ID: 1RH2), 模板與靶序列間的一致性為87%。圖2表明，樹鼩和人IFN-α1空間結構相似, 可形成5個α螺旋(ABCDE), 具有典型的“螺旋形細胞因子”的特征(Conklin, 2004; Karpusas et al, 1997)。Uzé et al (1994, 1995)研究表明，螺旋結構在I型IFN與受體結合中具有決定性作用。其中, 第1和第3個螺旋(Aα、Cα螺旋)是與I型IFN受體1 (interferon alpha receptor 1, IFNAR1)的結合位點; 第4個螺旋(Dα螺旋)、AB螺旋和DE螺旋之間的連接環(huán)則是與I型IFN受體2 (interferon α receptor 2, IFNAR2)的結合位點。同時, 根據現有的序列信息(未列出), 我們亦可推知, 樹鼩I型IFN其他亞型與受體結合的區(qū)域與人類相應區(qū)域結構均高度近似。此外, 與人IFN-α1相比, 樹鼩IFN-α1中具有兩個N糖基化位點, 結合糖基化在蛋白質中的重要作用(Lis & Sharon, 1993), 推測其增強了樹鼩IFN-α1與其受體的結合能力。

表1 NCBI中幾個物種I型IFN及預測得到的樹鼩I型IFNTab.1 Type I IFNs of several species in NCBI and predicted type I IFNs of Tupaia belangeri

2.3 樹鼩II型IFN的基本構成和特征分析

運用上述分析方法, 我們預測得出兩段與人II型IFN相近似的樹鼩IFN-γ序列, 相似度分別為68%和63%。參照各物種IFN-γ的基因結構, 亦可推知, 這兩段編碼序列分別來自樹鼩IFN-γ的第1和第4個外顯子。

根據現有信息, 我們所得到的僅為2個較小的片段, 共82個氨基酸, 未能預測到中間約84個氨基酸的編碼序列。這也說明現有基因組序列的局限性和不完整性，但氨基酸序列同源性和物種親緣分析顯示(表2), 除黑猩猩外, 人與樹鼩的序列相似度最高, 達到了68%。這一結果顯示了樹鼩IFN-γ的存在, 同時也為我們克隆IFN-γ全長基因及進一步的功能分析提供了必要的線索。

2.4 樹鼩III型IFN的基本構成和特征分析

圖1 樹鼩、人、小鼠、大鼠、牛、馬、豬IFN-α1氨基酸多序列比對Fig.1 Alignment of amino acid sequences of tree shrew IFN-α1 with those from other mammals

圖2 人(左)、樹鼩(右)IFN-α1分子蛋白質三維結構比較Fig.2 Comparison between the IFN-α1 protein three-dimensional structures of human (left) and tree shrew (right)

圖 3 樹鼩、人IFN-γ序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of tree shrew and human IFN-γ

表2 物種間IFN-γ在氨基酸水平上相似性百分比Tab.2 Percentage of amino acid sequence similarity of IFN-γ between Homo sapiens, Chimpanzee, Sus scrofa, Mus musculus, Rattus norvegicus, Bos taurus, Equus caballus, Ovis aries, Felis catus, Canis lupus and Tupaia belangeri

自2003年發(fā)現III型IFN以來(Kotenko et al, 2003; Sheppard et al, 2003),在人、小鼠、蝙蝠、魚、爪蟾、雞等物種中已有研究報道(表3), 但各物種相應的基因結構較為復雜。人含有3個III型IFN基因, 分別為IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)和IFN-λ3(IL-28B), 定位于19號染色體。小鼠第7號染色體上具有2個III型IFN編碼基因(IFN-λ2、IFN-λ3)和1個假基因(IFN-λ1)(Lasfar et al, 2006)。蝙蝠可有效編碼IFN-λ1和IFN-λ2, 而與人同源的IFN-λ3為假基因。此外, 蝙蝠IFN-λ1基因的第2內含子長達4 kb, 與人和其他哺乳動物對應區(qū)域1.1 kb的長度差異較大(Zhou et al, 2011)。值得注意的是, 雞僅有1個III型IFN有效編碼基因, 位于7號染色體(Karpala et al, 2008), 而爪蟾則有4個(IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ5)有效編碼基因和1個是一個假基因(IFN-λ4)(Qi et al, 2010)。因此,參照多物種數據系統(tǒng)研究樹鼩IFN-λs基因結構和蛋白功能對充分理解樹鼩III型IFN具有重要意義。

我們的預測發(fā)現, 在樹鼩全基因組中有2條序列與人IFN-λs具有較高同源性。其中, 1條序列具有從起始密碼子到終止密碼子的全長編碼框, 與人IFN-λ2和IFN-λ3均具有82%的序列相似性, 因此，暫命名為IFN-λ2/3。據此預測結果我們已將此585 bp的基因克隆并雙向測序。

表3 目前已克隆的幾個物種III型IFN及預測所得樹鼩III型IFNTab.3 Type III IFNs of several species which have been cloned and those predicted type III IFNs in Tupai belangeri

就基因結構而言, III型IFN與I型IFN僅有1個外顯子的特點明顯不同, 它們均由5個(IFN-λ1、IFN-λ3)或6個外顯子(IFN-λ2)構成(Uzé & Monneron, 2007)。利用Fancy GENE v1.4(Rambaldi & Ciccarelli, 2009), 我們構建了樹鼩IFN-λ2/3與人IFN-λs內含子-外顯子模式圖(圖4), 顯示樹鼩IFN-λ含有5個外顯子和4個內含子結構, 具III型IFN的典型特征, 且其內含子?外顯子的大小與人IFN-λ2基本一致。

圖4 人IFN-λ與樹鼩IFN-λ2/λ3內含子?外顯子結構比較Fig.4 Comparison of the intron-exon structure of tree shrew IFN-λ2/3 with those of human IFN-λs genes

以人IFN-λ2/3結構(PDB ID: 3HHC)為模板(模板與靶序列間的序列一致性為82%), 用Discovery Studio對樹鼩IFN-λ2/3的蛋白三維結構進行了分子模建。結果顯示(圖5), 樹鼩IFN-λ2/3結構(圖5C)在整體上與人IFN-λ2/3結構(圖5B)相似, 而與人IFN-λ1(圖5A)差別很大。此外, 樹鼩與人IFN-λs都由多個α螺旋構成, 具有典型的II型細胞因子家族蛋白結構特點(Zdanov, 2010)。人IFN-λ1具有N糖基化位點, 而IFN-λ2/3不具有相類似的糖基化位點(Dellgren et al, 2009), 結合糖基化在維持蛋白質與蛋白質之間結合中的作用(Lis & Sharon, 1993),推測IFN-λ1比IFN-λ2/3與受體結合能力更強, 從而起抗病毒中決定性作用。

圖5 人IFN-λ1(A)、人IFN-λ2/3(B)和樹鼩IFN-λ2/3(C)蛋白質結構模型Fig.5 Protein structural models of human IFN-λ1(A), IFN-λ2/3(B) and tree shrew IFN-λ2/3(C)

綜上所述, 借助于現有的樹鼩全基因組序列信息, 我們首次對樹鼩IFN家族成員進行了系統(tǒng)挖掘, 并對其結構?功能進行了初步探討，為進一步發(fā)現、驗證樹鼩IFN家族的其他成員以及相關功能研究奠定了基礎。

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Genome-wide prediction of interferon family members of tree shrew and their molecular characteristics analysis

LI Ming-Li1,2, TIAN Wei-Wei1,3, GAO Yue-Dong4,5, GUO Yan1, HUANG Jing-Fei4,5, ZHANG Hua-Tang1,*

(1. Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. College of Biotechnology, Southwest University, Beibei 400715, China; 4. Kuming Biological Diversity Regional Center of Large Apparatus and Equipment, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 5. State Key laboratory of Genetic Resources and Evolution, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China)

Interferons (IFNs) represent proteins with antiviral activities that are secreted from cells in response to a variety of stimuli. In addition to antiviral, antibacterial and anti-parasitic host-defense functions they are now also recognized as crucial regulators of cell proliferation, differentiation, survival and death as well as activators of specialized cell functions particularly in the immune system and play important roles in infectious and inflammatory diseases, autoimmunity and cancer. Tree shrews (Tupaia belangeri) were found to be susceptible to several human viruses and therefore are widely regarded as good models for analyzing mechanism of human diseases. In this report, we have forecasted the interferon family members of tree shrew from its genome mainly using the methods like Blast (whole genome shotgun sequence) and gene prediction. Our data show that tree shrew interferon system includes: type I IFN: α (five subtypes), β, ω, κ, ε, δ; type II IFN: γ; type III IFN: λ1, λ2/3. Furthermore, the predicted structures of α and λ have similar character with those of other mammals. However, there are some differences in cysteine position and N-glycosylation numbers between human and Tree shrew IFNs. These results provide fundamental basis for further molecular cloning and function analysis of tree shrew IFNs in future.

Tree shrews; Interferon; Whole genome sequence alignment; Gene prediction

碩士研究生, E-mail: limingli@mail.kiz.ac.cn

Q959.832; Q951.3; Q347

A

0254-5853-(2012)01-0067-08

10.3724/SP.J.1141.2012.01067

2011-10-24；接受日期：2012-01-10

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(“973”計劃)分課題(2007CB512807);中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(KSCX2-EW-R-12);中國科學院基礎前沿研究專項項目(KSCX2-EW-J-23);中科院昆明動物研究所“動物模型與人類疾病機理重點實驗室”開放課題

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: zhanght@mail.kiz.ac.cn