田巍威, 高躍東, 郭 彥, 黃京飛, 肖 昌, 李作生, 張華堂,*

(1. 西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院, 重慶 北碚 400715; 2. 云南沃森生物技術(shù)股份有限公司, 云南 昆明 650106; 3. 中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 免疫生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650223; 4. 中國科學(xué)院昆明生物多樣性大型儀器區(qū)域中心,云南 昆明 650223; 5. 中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 遺傳資源與進(jìn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 云南 昆明 650223)

樹鼩CD4全長(zhǎng)編碼序列的克隆及分子特征分析

田巍威1,2,3, 高躍東4,5, 郭 彥3, 黃京飛4,5, 肖 昌1, 李作生2,*, 張華堂3,*

(1.西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院,重慶 北碚400715; 2.云南沃森生物技術(shù)股份有限公司,云南 昆明650106; 3.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;免疫生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650223; 4.中國科學(xué)院昆明生物多樣性大型儀器區(qū)域中心,云南 昆明650223; 5.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 遺傳資源與進(jìn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明650223)

樹鼩作為多種人類疾病研究模型的可能性已受到廣泛關(guān)注, 但尚缺乏研究其免疫功能的基本標(biāo)志以及單克隆抗體。該實(shí)驗(yàn)首先以樹鼩外周血總RNA為材料, 通過RT-PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為1 365 bp的樹鼩CD4全長(zhǎng)編碼序列, 并確定了數(shù)據(jù)庫中缺失的兩個(gè)片段, 進(jìn)而通過Clustal W等軟件對(duì)其序列和分子特征進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)樹鼩CD4氨基酸序列胞外和胞內(nèi)域保守性較好，且與人類和猴的親緣關(guān)系較近。雖然樹鼩和人CD4分子表面大部分區(qū)域均帶正電荷, 但與人CD4胞外域D1相比, 樹鼩CD4 D1結(jié)構(gòu)區(qū)域表面帶負(fù)電荷較多, 且多出兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。這些差異對(duì)抗體的結(jié)合可能存在影響。該研究為今后樹鼩CD4單克隆抗體制備及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

樹鼩; CD4分子; RT-PCR; 結(jié)構(gòu); 功能; 單克隆抗體

CD4是具有4個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域的單鏈跨膜糖蛋白,主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞, 參與T細(xì)胞的活化(Zeitlmann et al, 2001)。作為T輔助細(xì)胞(T-helper)活化的協(xié)同受體(co-receptor), 其胞外域可以與MHC-II (major histocompatibility complex class II)結(jié)合, 穩(wěn)定TCR與抗原肽-MHC- II復(fù)合物之間的相互作用(Grakoui et al, 1999)；而其胞內(nèi)域中的保守基序KKTCQC能與酪氨酸蛋白激酶Src家族成員p56lck結(jié)合, 參與T細(xì)胞活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程(Glaichenhaus et al, 1991)。

樹鼩(tree shrews,Tupaia belangeri)是一類外型酷似松鼠的小型哺乳動(dòng)物, 主要分布于我國西南部、菲律賓、印度等地(Cao et al, 2003)。早在1987年, Su et al (1987)發(fā)現(xiàn)成年樹鼩接種人HBV感染血清后, 其血清中能夠檢測(cè)到乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)。Walter et al (1996)報(bào)道新生樹鼩經(jīng)人HBV感染后, 表現(xiàn)出類似人類的急性自限性肝炎。此外, 已有報(bào)道樹鼩對(duì)HCV、HSV亦具有易感性(Zhao et al, 2002; Darai et al, 1980)。由于樹鼩對(duì)多種人類病毒易感且個(gè)體小、易于飼養(yǎng), 其作為多種人類疾病研究模型的可能性已受到廣泛關(guān)注。

目前, 針對(duì)樹鼩CD4的研究較少, 僅有根據(jù)樹鼩2倍覆蓋率基因組結(jié)合參考人類CD4 (HGNC ID:1678)預(yù)測(cè)所得序列, 且存在兩處未知片段, 影響了單克隆抗體制備中CD4抗原表位分析。為此,本研究首先以獲得樹鼩CD4完整編碼序列為目的,同時(shí)比較分析其分子特征, 為樹鼩CD4單克隆抗體的制備和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

本研究采用的滇緬樹鼩購于云南省昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 樹鼩CD4全長(zhǎng)編碼序列克隆

根據(jù)已有預(yù)測(cè)樹鼩CD4序列(http://asia. ensembl.org/index.html, ENSTBEG00000000662),上游引物設(shè)計(jì)為:5'-ATGGACCGCCCAGTCCGG-3', 由于上述序列3'端尚不完整, 因此參考人、狨毛猴等物種的CD4序列, 下游引物設(shè)計(jì)為: 5'-TCACATGAGACTACATGTCTTCTGAAACC-3'(圖1)。

圖1 樹鼩CD4已知序列和殘缺序列以及引物設(shè)計(jì)Fig.1 Primers for PCR amplification of tree shrews CD4 cDNA

采集樹鼩外周血, 提取血液總RNA (試劑盒購于BioTeKe), 將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用上述引物進(jìn)行PCR, 循環(huán)參數(shù)為：94 ℃, 3 min; 94 ℃ 30 s, 45 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 32個(gè)循環(huán); 72 ℃, 10 min (RT-PCR試劑盒購于TIANGEN)。用樹鼩管家基因GAPDH(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase)作為陽性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆插入pMD-19T載體后, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定, 最終進(jìn)行雙向測(cè)序(北京三博志遠(yuǎn)基因技術(shù)有限公司)。

1.3 分子特征分析

本文用以參比的核酸序列均來源于GenBank,以DNAMAN6.0、BlastP、Clustal W2.0、MEGA4、Discovery Studio和PyMOL分別進(jìn)行核酸序列、氨基酸序列、物種親緣關(guān)系分析及蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模建。而信號(hào)肽和跨膜域結(jié)構(gòu)分析則采用在線預(yù)測(cè)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/; http://www. ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹鼩CD4全長(zhǎng)編碼序列擴(kuò)增與比較分析

利用樹鼩外周血總RNA, 通過RT-PCR獲得長(zhǎng)度約為1 365 bp的核酸片段(圖2)。通過雙向測(cè)序,我們確定了所得序列為樹鼩CD4分子全長(zhǎng)編碼序列, 開放閱讀框長(zhǎng)度為1 365 bp, 編碼454個(gè)氨基酸（GenBank登陸號(hào)為JN657224）。通過DNAMAN 6.0進(jìn)行多序列比對(duì)，所獲得樹鼩CD4編碼序列確定了原預(yù)測(cè)序列(ENSTBEG00000000662)中第611～797、1 019～1 357的殘缺片段, 共計(jì)526 bp (圖3)。同時(shí), 我們發(fā)現(xiàn)已測(cè)序列與原預(yù)測(cè)序列存在差異(表1)。此外, 原預(yù)測(cè)序列中第798～803、1 358～1 360位9個(gè)堿基, 未在我們實(shí)測(cè)序列中未檢出, 而我們實(shí)測(cè)序列第901～903位的3個(gè)堿基在原預(yù)測(cè)序列中未檢出, 但上述差異并未導(dǎo)致移碼突變。本實(shí)驗(yàn)采用高保真Pfu酶擴(kuò)增基因并進(jìn)行兩次雙向測(cè)序, 有效地排除了實(shí)驗(yàn)誤差。因此, 我們所獲得的樹鼩CD4分子全長(zhǎng)編碼序列是較為準(zhǔn)確的。

圖2 樹鼩CD4 cDNA擴(kuò)增Fig.2 RT-PCR amplification of tree shrews CD4 cDNA

圖3 樹鼩CD4預(yù)測(cè)序列未知片段及對(duì)應(yīng)氨基酸Fig.3 The two unknown fragments of the predicted tree shrews CD4 cDNA and the corresponding amino acid

表1 樹鼩CD4 cDNA預(yù)測(cè)序列與實(shí)測(cè)序列差異性比較Tab. 1 Comparison of the predicted tree shrews CD4 cDNA sequence and the obtained sequence

氨基酸差異

Amino acid differencesSer→ProArg→Trp Ile→Val Gly→Ser Asn→Ser Ser→Thr Thr→Ala Gln→Arg Val→Gly Ser→Thr Thr→Leu Arg→Gly

2.2 樹鼩CD4氨基酸序列分析

2.2.1 樹鼩CD4整體結(jié)構(gòu)與親緣關(guān)系分析

圖4 樹鼩CD4推導(dǎo)氨基酸序列比對(duì)分析Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequences of tree shrews CD4 with those from other mammals

樹鼩CD4分子由454個(gè)氨基酸組成, 屬于Ⅰ型跨膜蛋白。信號(hào)肽和跨膜域在線預(yù)測(cè)顯示, 樹鼩CD4整體結(jié)構(gòu)與人CD4相似, 可分為信號(hào)肽(1～25)、胞外域(26～392)、跨膜域(393～416)、胞內(nèi)域(416～454)四部分(圖4), 我們采用Blast P及Clustal W2.0對(duì)推導(dǎo)得到的樹鼩CD4(JN_657224)氨基酸序列與人(NM_000616)、恒河猴(NM_001042662)、狼犬(NM_001003252)、穴兔(NM_001082313)、綿羊(NM_001129902)、大鼠(NM_013488)、小鼠(NM_012705)等哺乳動(dòng)物進(jìn)行比較(圖4), 發(fā)現(xiàn)樹鼩CD4氨基酸序列與人類、恒河猴的相似度較高, 分別為61%、60%, 而與大鼠、小鼠的相似度較低, 分別為48%、46%。同時(shí), 我們利用MEGA4對(duì)樹鼩CD4親緣關(guān)系進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示, 樹鼩與人類、恒河猴聚集, 而與大鼠、小鼠距離較遠(yuǎn), 說明樹鼩在進(jìn)化關(guān)系上跟人類和恒河猴更接近(圖5)。

圖5 樹鼩和其他哺乳動(dòng)物CD4之間的親緣關(guān)系Fig.5 Phylogentic relationships between CD4 chains from tree shrews and other mammals

2.2.2 樹鼩CD4胞外域特征

人CD4胞外域主要由4個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)D1、D2、D3、D4組成, 胞外域中存在3對(duì)二硫鍵。它們分別是形成于D1結(jié)構(gòu)的Cys41和Cys109；D2結(jié)構(gòu)的Cys155和Cys184；D4結(jié)構(gòu)的Cys328和Cys370(Matthias et al, 2002)。通過Discovery Studio,我們對(duì)人和樹鼩的CD4胞外域進(jìn)行了三維空間結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示, 樹鼩CD4胞外域和人CD4胞外域整體相似, 都可分為四個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu),在樹鼩的D1和D4結(jié)構(gòu)域中能找到相應(yīng)的二硫鍵,但形成D2中二硫鍵的Cys155未能找到, 相應(yīng)位置被色氨酸占據(jù)(圖6B)。在CD4氨基酸多序列比對(duì)中, 狼犬、穴兔、綿羊的CD4胞外域相應(yīng)位置同樣也為色氨酸(圖4)。由于這種差異并沒有破壞樹鼩D2結(jié)構(gòu)的形成, 我們認(rèn)為色氨酸的存在可能在一定程度上彌補(bǔ)了二硫鍵缺失所帶來的影響, 但這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

同時(shí), 人CD4分子中保守性氨基酸殘基Leu134、Leu202、Leu225、Leu308能夠形成疏水域, 而Gln137和Gly306之間能夠形成分子內(nèi)氫鍵, 它們能夠保證D1和D2之間以及D3和D4之間的緊密連接(Wang et al, 1990)。在樹鼩CD4胞外域的相應(yīng)位置同樣存在上述保守性氨基酸, 這些氨基酸在維持樹鼩CD4穩(wěn)定性方面可能起到重要作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 人D1中的α-螺旋在樹鼩中同樣存在,而α-螺旋的存在一定程度可以確保肽鏈的正確折疊和空間結(jié)構(gòu)的形成。綜合以上分析, 我們所獲得的樹鼩CD4分子胞外域能夠形成同人相似的三維空間結(jié)構(gòu)。

人CD4胞外區(qū)與MHC-II的結(jié)合主要依靠D1、D2結(jié)構(gòu),特別是D1上的4個(gè)帶正電的氨基酸殘基(Lys60、Phe68、Lys71和Arg84)(Wang et al, 2001),但在我們的序列比對(duì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn), 樹鼩CD4分子D1中的后3個(gè)核心氨基酸殘基都與人存在差異, 而這種差異在氨基酸多序列比對(duì)的其它物種中同樣存在(圖4)。這說明在各物種間CD4與MHC-II結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)并不保守。CD4的D1結(jié)構(gòu)同時(shí)也是大多數(shù)單克隆抗體結(jié)合的區(qū)域, 如BD公司針對(duì)人CD4D1區(qū)的鼠抗人CD4抗體(克隆號(hào)：RPA-T4)。通過人與樹鼩CD4胞外域三維空間結(jié)構(gòu)比較, 我們發(fā)現(xiàn)樹鼩在D1區(qū)存在兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn), 而在人的D1區(qū)卻不存在(圖6A, B), 在人CD4 D3中存在一個(gè)N-糖基化位點(diǎn), 在樹鼩CD4分子的D3中未檢測(cè)到, 而在樹鼩CD4分子的D4中包含一個(gè)人D4結(jié)構(gòu)中不存在的α-螺旋(圖6C, D)。以上差異并沒有導(dǎo)致樹鼩與人CD4胞外域產(chǎn)生較大不同, 其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。此外, 我們對(duì)人與樹鼩CD4胞外域的絕對(duì)電荷分布進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)人和樹鼩CD4表面大部分區(qū)域均帶正電荷, 負(fù)電荷主要分布于D1和D4表面, 且樹鼩D1表面負(fù)電荷分布較人D1表面多(圖6E, F)。樹鼩CD4的D1區(qū)在N-糖基化位點(diǎn)數(shù)目和表面電荷上與人CD4的差異可能影響樹鼩CD4分子與其它分子的結(jié)合, 例如我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)鼠抗人CD4抗體不能與樹鼩CD4發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖6 人和樹鼩CD4胞外域蛋白三維結(jié)構(gòu)模建和表面電荷比較Fig.6 Modeling of three-dimensional structures and surface charges of the extracellular domain of human and tree shrews CD4 chains

2.2.3 樹鼩CD4胞內(nèi)域特征

CD4氨基酸多序列比對(duì)顯示樹鼩和其它物種的CD4胞內(nèi)域高度保守(圖4), 提示該結(jié)構(gòu)域參與了CD4分子重要功能。Glaichenhaus et al (1991)報(bào)道CD4分子胞內(nèi)域中KKTCQC基序是Src家族酪氨酸蛋白激酶p56lck的結(jié)合區(qū)域, 其中的兩個(gè)半胱氨酸是CD4與p56結(jié)合所必需的(Learmont et al, 1999),而p56lck在去磷酸化激活狀態(tài)下, 能夠造成CD3胞內(nèi)域ITAM的磷酸化, 進(jìn)而引起fyn和ZAP-70等下游信號(hào)分子的激活, 最終完成T細(xì)胞活化(Leo & Schraven, 2001; Kane et al, 2000)。在樹鼩CD4胞內(nèi)域中, 我們同樣檢測(cè)到高度保守的KKTCQC基序的存在(圖4), 明確提示樹鼩CD4具有與p56lck結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ), 進(jìn)而參與樹鼩T淋巴細(xì)胞的活化。

我們?cè)跇潼欿KTCQC基序上游檢測(cè)到兩個(gè)保守的絲氨酸殘基和兩個(gè)保守的亮氨酸殘基(圖4)。這4個(gè)保守氨基酸參與人CD4的內(nèi)化(internalization),其中兩個(gè)保守的絲氨酸殘基的磷酸化是CD4內(nèi)化的信號(hào), 而CD4分子內(nèi)化可以下調(diào)細(xì)胞表面CD4的表達(dá), 控制T淋巴細(xì)胞的過度活化, 保持免疫系統(tǒng)的平衡(Shin et al, 1990)。我們推測(cè)樹鼩CD4胞內(nèi)域中的這4個(gè)保守性氨基酸亦參與了樹鼩CD4的內(nèi)化過程。此外, 我們發(fā)現(xiàn)以上基序在比對(duì)的其他哺乳動(dòng)物中也同樣存在(圖4), 提示大多數(shù)哺乳動(dòng)物CD4胞內(nèi)域重要基序在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中具有高度的保守性。

綜上, 本研究通過RT-PCR擴(kuò)增得到樹鼩CD4全長(zhǎng)編碼序列, 確定了原預(yù)測(cè)序列中未知的兩處片段, 同時(shí), 對(duì)其分子特征進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明：樹鼩CD4氨基酸序列與人和恒河猴的親緣關(guān)系較近, 其胞外域整體結(jié)構(gòu)與人CD4胞外域相似的。而CD4與MHC-II結(jié)合相關(guān)的4個(gè)核心氨基酸在各物種中差異較大, 同時(shí), 胞外域的潛在N-糖基化位點(diǎn)、α-螺旋以及表面電荷的分布也存在差異。這些差異的存在有利于對(duì)樹鼩CD4結(jié)構(gòu)與功能特點(diǎn)的進(jìn)一步分析。

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Cloning of full-length coding sequence of tree shrew CD4 and prediction of its molecular characteristics

TIAN Wei-Wei1,2,3, GAO Yue-Dong4,5, GUO Yan3, HUANG Jing-Fei4,5, XIAO Chang1, LI Zuo-Sheng2,*, ZHANG Hua-Tang3,*

(1. College of Biotechnology, Southwestern University, Beibei 400715, China; 2. Yunnan Walvax Biotechnology Co., LTD Kunming 650106, China; 3. Immunobiology Laboratory, Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Science, Kunming 650223, China; 4. Kunming Biological Diversity Regional Center of Large Apparatus and Equipment, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 5. State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China)

The tree shrews, as an ideal animal model receiving extensive attentions to human disease research, demands essential research tools, in particular cellular markers and monoclonal antibodies for immunological studies. In this paper, a 1 365 bp of the full-length CD4 cDNA encoding sequence was cloned from total RNA in peripheral blood of tree shrews, the sequence completes two unknown fragment gaps of tree shrews predicted CD4 cDNA in the GenBank database, and its molecular characteristics were analyzed compared with other mammals by using biology software such as Clustal W2.0 and so forth. The results showed that the extracellular and intracellular domains of tree shrews CD4 amino acid sequence are conserved. The tree shrews CD4 amino acid sequence showed a close genetic relationship withHomo sapiensandMacaca mulatta. Most regions of the tree shrews CD4 molecule surface showed positive charges as humans. However, compared with CD4 extracellular domain D1 of human, CD4 D1 surface of tree shrews showed more negative charges, and more two N-glycosylation sites, which may affect antibody binding. This study provides a theoretical basis for the preparation and functional studies of CD4 monoclonal antibody.

Tree shrews; CD4; RT-PCR; Structure; Function; Monoclonal antibody

田巍威, 碩士研究生, E-mail: vivit1986@126.com

Q959.832; Q951.3; Q347

A

0254-5853-(2012)01-0060-07

10.3724/SP.J.1141.2012.01060

2011-10-09；接受日期：2012-01-05

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)分課題(2007CB512807);中科院知識(shí)創(chuàng)新工程重要方向項(xiàng)目(KSCX2-EW-R-12);樹鼩基礎(chǔ)生物學(xué)及重要生物學(xué)特性研究(Y002732073);中科院昆明動(dòng)物研究所“動(dòng)物模型與人類疾病機(jī)理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”開放課題

?通信作者(Corresponding authors)，E-mail: zhanght@post.kiz.ac.cn; jxdxlzs@yahoo.com.cn