翟洪建 王風(fēng)波 虞樂(lè)華

1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610500；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶 400010

宮內(nèi)感染（intrauterine infection）作為新生兒腦白質(zhì)損傷（NWMD）的重要致病因素，已得到廣泛證實(shí)。少突膠質(zhì)細(xì)胞（OL）及腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘的損傷均是NWMD的主要病理特點(diǎn)，OL的成熟前體是少突膠質(zhì)前體細(xì)胞（OPCs），對(duì)感染和缺血極為敏感。本研究建立先天性腦損傷仔鼠模型，經(jīng)電針干預(yù)治療，電子顯微鏡下觀(guān)察腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘的超微結(jié)構(gòu)，測(cè)量并計(jì)算出髓鞘厚度平均值，進(jìn)而從髓鞘厚度的角度探討電針治療對(duì)先天性腦損傷及腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)成熟Wistar雌性大鼠38只，雄性大鼠19只，體重≥210 g，全部由四川動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；脂多糖（LPS血清型055：B5，美 國(guó)SIGMA公 司）；120KV透 射 電 子 顯 微 鏡（JEM-1200EX)（日本電子株式會(huì)社）。

1.2 方法

參照王風(fēng)波等[1]方法使用的制備宮內(nèi)感染致先天性腦損傷仔鼠模型。孕鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（n=4）和LPS組（n=29），兩組均去除孕22 d前分娩的早產(chǎn)鼠。仔鼠出生后，對(duì)胎盤(pán)做HE染色病理學(xué)檢測(cè)，大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為宮內(nèi)感染的判斷標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選取生理鹽水對(duì)照組仔鼠22只（n=22），LPS組仔鼠40只（n=40）；LPS組仔鼠隨機(jī)分為非干預(yù)組22只（n=22）、電針組18只（n=18）；于24 h隨機(jī)處死對(duì)照組和非干預(yù)組仔鼠各4只，行腦組織病理學(xué)檢測(cè)。電針組仔鼠于第7天開(kāi)始進(jìn)行電針干預(yù)，對(duì)照組、非干預(yù)組仔鼠均常規(guī)飼養(yǎng)。分別于第14天、第28天取各組仔鼠腦白質(zhì)測(cè)量神經(jīng)髓鞘厚度。

1.3 電針干預(yù)

選取仔鼠百會(huì)、曲池及足三里諸穴，具體操作參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[2]及王風(fēng)波等[1]方法：仔鼠頂骨正中定百會(huì)，橈骨近端的關(guān)節(jié)外側(cè)凹陷處取曲池，膝關(guān)節(jié)后外側(cè)腓骨小頭下約5 mm處定足三里，采用直徑0.2 mm、長(zhǎng)20 mm的華佗牌針灸針，各穴均連接電針儀，調(diào)設(shè)連續(xù)波，5～10 Hz頻率，3～5 V強(qiáng)度，以頭部輕微抖動(dòng)為宜，持續(xù)刺激10 min。每日1次，干預(yù)至第28天。

1.4 電鏡標(biāo)本及圖片制作

參照王風(fēng)波等[3]方法制備常規(guī)腦白質(zhì)電鏡標(biāo)本，用球切法（isector）包埋抽取出的腦白質(zhì)組織塊，確保各方向分布的神經(jīng)纖維均有相同抽樣概率，再以常規(guī)電鏡包埋法包埋組織塊，每個(gè)包埋好的腦白質(zhì)組織塊隨機(jī)切取一張60 nm的超薄切片，透射電子顯微鏡下觀(guān)察髓鞘情況，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，放大20 000倍拍照。

1.5 腦神經(jīng)髓鞘厚度測(cè)量方法

參照Larsen[4]方法，在放大20 000倍的照片上隨機(jī)疊加等距測(cè)試線(xiàn)，計(jì)數(shù)每個(gè)待測(cè)髓鞘斷面的內(nèi)外邊界與測(cè)試線(xiàn)的交叉點(diǎn)數(shù)，將髓鞘內(nèi)邊界與測(cè)試線(xiàn)的交點(diǎn)按順序編號(hào)，總數(shù)為I，隨機(jī)選取前I/4中的一個(gè)編號(hào)作為首個(gè)髓鞘厚度的測(cè)試點(diǎn)，其所在位置+I/4為第二個(gè)測(cè)試點(diǎn)，第三個(gè)測(cè)試點(diǎn)為第二點(diǎn)位置+I/4，第四個(gè)測(cè)試點(diǎn)為第三點(diǎn)位置+I/4，于這4個(gè)測(cè)試點(diǎn)處分別測(cè)量髓鞘內(nèi)外邊界的最短距離，取其平均值為髓鞘厚度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用q檢驗(yàn)，非正態(tài)分布和方差不齊時(shí)，用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎盤(pán)病理檢查結(jié)果及新生仔鼠腦組織病理改變

LPS組孕鼠胎盤(pán)內(nèi)見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組母鼠胎盤(pán)無(wú)炎癥反應(yīng)。LPS組仔鼠腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，其內(nèi)大量膠質(zhì)細(xì)胞聚集，并有血管擴(kuò)張，腦室內(nèi)出血等病理改變；對(duì)照組仔鼠腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯膠質(zhì)細(xì)胞聚集、血管擴(kuò)張及出血等，且核仁清楚，布局有序。

2.2三組仔鼠腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘厚度測(cè)量結(jié)果

非干預(yù)組、電針組仔鼠腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘厚度平均值均明顯低于對(duì)照組，組間差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）；電針組仔鼠髓鞘厚度平均值高于非干預(yù)組（P﹤0.01）；各組第14天與第28天組內(nèi)比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹤0.01）。見(jiàn)表1、圖1～3。

表1 三組仔鼠腦神經(jīng)髓鞘平均厚度檢測(cè)情況比較(±s)

表1 三組仔鼠腦神經(jīng)髓鞘平均厚度檢測(cè)情況比較(±s)

注：與對(duì)照組比較，*P﹤0.01；與非干預(yù)組比較，△P﹤0.01；與同組14 d比較，▲P﹤0.01

組別14 d只數(shù) 髓鞘平均厚度（nm）28 d只數(shù) 髓鞘平均厚度（nm）對(duì)照組非干預(yù)組電針組999 109.7667±9.7985 65.4457±6.9376*88.5768±2.6786*△999 126.5667±4.5768▲88.4465±5.3365*▲110.5546±4.6673*△▲

圖1 對(duì)照組14日齡仔鼠腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘（電鏡×20 000）

圖2 非干預(yù)組14日齡仔鼠腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘（電鏡×20 000）

圖3 電針組14日齡仔鼠腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘（電鏡×20 000）

3 討論

神經(jīng)髓鞘由OL突起的胞膜包卷軸突而成，脫髓鞘損害與OL受損息息相關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）髓鞘缺失的主要因素包括髓鞘合成障礙及過(guò)多破壞兩方面，髓鞘合成障礙多見(jiàn)于先天性損傷，如腦室周?chē)踪|(zhì)軟化（PVL），髓鞘的過(guò)多破壞則見(jiàn)于繼發(fā)于全身性疾病和炎性脫髓鞘病(IIDDs)[5]。PVL通常出現(xiàn)于妊娠第28～34周，是NWMD的主要表現(xiàn)形式。宮內(nèi)感染是WMD的重要病因之一，不但可以直接侵犯胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而且可以通過(guò)引起炎癥反應(yīng)和干擾胎盤(pán)血流循環(huán)致胎兒腦的血供減少，引起胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性和缺血性損傷[6]。王風(fēng)波等[3]研究顯示，宮內(nèi)感染可致腦損傷仔鼠腦白質(zhì)神經(jīng)脫髓鞘損害。OL是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要類(lèi)型之一，主要參與髓鞘的形成，其成熟前期的OPCs對(duì)感染和缺血極為敏感，NWMD的主要病理表現(xiàn)即包括髓鞘與軸突的損害。髓鞘的修復(fù)與再生是人體復(fù)雜的自我調(diào)節(jié)功能之一，神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均參與到其各個(gè)階段的精細(xì)調(diào)控，大腦白質(zhì)內(nèi)大量的并行的髓鞘化軸突毗鄰OL，接受OL提供的髓鞘形成所需的必要物質(zhì)，若OL受到損傷，與其毗鄰的軸突便將面臨髓鞘缺損的狀況。OL還可合成新的髓鞘來(lái)包繞暴露的軸突，并且通過(guò)釋放各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促使受損軸突的修復(fù)[7]；同時(shí)，遭受失髓鞘的神經(jīng)元自身的功能恢復(fù)，也對(duì)髓鞘的修復(fù)和再生有著重要的作用。另外，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的另外兩種類(lèi)型：小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，在WMD發(fā)生后很快反應(yīng)，通過(guò)次級(jí)激活，產(chǎn)生數(shù)量龐大的細(xì)胞因子，進(jìn)而激活前體細(xì)胞，對(duì)于髓鞘再生亦是不可或缺的因素[8]。而早期的積極干預(yù)對(duì)WMD的治療作用毋庸置疑，王風(fēng)波等[3]發(fā)現(xiàn)，早期豐富康復(fù)訓(xùn)練不但能在形態(tài)上改善腦損傷仔鼠腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘的狀況，并且能顯著地增強(qiáng)仔鼠腦組織腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的陽(yáng)性表達(dá)，對(duì)受損神經(jīng)髓鞘的修復(fù)和再生具有積極地促進(jìn)作用。

針刺治療腦損傷歷史悠久，療效確切，對(duì)于穴位的解釋?zhuān)瑐鹘y(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，百會(huì)屬督脈穴，與腦密切相關(guān)，曲池、足三里屬陽(yáng)明經(jīng)合穴，功效醒腦開(kāi)竅，針刺督脈百會(huì)穴及陽(yáng)明經(jīng)合穴治療腦損傷，可振奮周身之陽(yáng)氣，疏經(jīng)通絡(luò)，促進(jìn)氣血運(yùn)行，促進(jìn)肢體功能康復(fù)。電針療效明顯優(yōu)于單純針刺或電刺激，已得到大量研究證實(shí)。王風(fēng)波等[3]取“百會(huì)、足三里”諸穴，對(duì)先天性腦損傷仔鼠進(jìn)行電針干預(yù)，發(fā)現(xiàn)腦損傷仔鼠腦組織BDNF陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)，對(duì)于腦損傷的功能重塑及恢復(fù)具有積極意義；芮君等[9]電針刺激腦缺血大鼠“百會(huì)、風(fēng)府”穴，腦組織BrdU／NSE和Brdu／GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量均明顯增多，進(jìn)而促進(jìn)中樞神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化。

基于以上理論及研究成果，本研究采用宮內(nèi)感染致先天性腦損傷仔鼠模型，參考王風(fēng)波等[3]采用的體視學(xué)技術(shù)，測(cè)量仔鼠腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘厚度并計(jì)算平均值，從腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘厚度的角度探討電針對(duì)先天性腦損傷的治療作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究說(shuō)明，積極而早期的電針干預(yù)可提高腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘厚度平均值，有利于腦白質(zhì)神經(jīng)髓鞘的修復(fù)與再生，為進(jìn)一步研究電針在小兒腦損傷治療的臨床運(yùn)用方面提供一定的客觀(guān)依據(jù)和積極的指導(dǎo)意義。

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