楊 敏 林煥冰 張金桃 曾永梅 陳佩瑜 耿嵐嵐 龔四堂

炎癥性腸病(IBD)是指原因不明的一組非特異性慢性復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥性疾病。目前應(yīng)用于臨床的生物制劑如抗-TNF 抗體(Infliximab、Adalimumab)及抗黏附分子抗體(Tysabri)，雖然治療IBD 療效肯定，但其價(jià)格昂貴，且有誘發(fā)腫瘤和感染可能。因此，開發(fā)有效、低毒及低成本的IBD治療藥物，備受研究者們的關(guān)注。中醫(yī)益氣健脾方劑有增強(qiáng)胃腸黏膜屏障功能、促進(jìn)黏膜防護(hù)因子表達(dá)等作用。組方中主要成分黃芪，其主要有效成分黃芪多糖(APS)可誘導(dǎo)多種細(xì)胞分化。本研究組前期利用人類全基因組表達(dá)譜基因芯片亦證實(shí)APS 可調(diào)控K562 細(xì)胞的增殖分化［1］;篩選出高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子NFATC4，在APS 調(diào)控細(xì)胞增殖分化中發(fā)揮重要作用，可能是參與APS 調(diào)控K562 細(xì)胞增殖分化的重要轉(zhuǎn)錄因子。本研究以三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)IBD 大鼠模型，觀察APS 對模型大鼠受損腸黏膜的修復(fù)作用，NFATC4 在結(jié)腸組織的表達(dá)，驗(yàn)證NFATC4 在APS 治療IBD 中的分子靶點(diǎn)作用，探討APS 維持及修復(fù)上皮屏障功能的作用機(jī)制，為臨床治療IBD 提供新的選擇。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SD 大鼠 SPF 級，體重(200 ±20)g，雄性，無菌環(huán)境飼養(yǎng)。南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 IBD 大鼠模型的建立 采用TNBS 誘導(dǎo)法，簡述如下:取成年健康雄性SD 大鼠，造模前禁食24 h，自由飲水，10%水合氯醛(300 mg·kg－1)麻醉后用直徑2.0 mm、長約12 cm 的硅膠管從肛門輕緩插入，深約8 cm，將150 mg·kg－1TNBS(3 mL·kg－1，即配成50 mg·mL－1)的50%乙醇溶液緩慢推入結(jié)腸，誘導(dǎo)IBD 形成。為確保注入的TNBS 能夠在大腸內(nèi)彌散分布，注入后將大鼠尾巴提起，持續(xù)倒置1 min。灌腸后24 h 大鼠出現(xiàn)懶動、厭食、腹瀉和黏液血便。

1.3 試劑 注射用APS(天津賽諾制藥有限公司，批號110502);NFATC4 ELISA 試劑盒(ADL 公司，美國)。

1.4 分組 將45 只大鼠隨機(jī)分為5 組，每組各9 只:假手術(shù)組(建模時(shí)僅給予50%乙醇溶液)、IBD 模型組(不予APS 干預(yù))、APS 低劑量組(100 mg·kg－1)、APS 高劑量組(200 mg·kg－1)和地塞米松對照組(地塞米松0.3 mg·kg－1，0.333 mg·mL－1)。建立IBD 模型后48 h 各組予腹腔注射相應(yīng)藥物，每日1 次，給藥7 d。

1.5 樣品制備 乙醚麻醉下處死大鼠，截取自肛門向上8 cm 結(jié)腸，沿系膜縱行剪開，冰PBS 沖洗干凈，肉眼評估結(jié)腸黏膜損傷程度。在新鮮結(jié)腸標(biāo)本上沿腸系膜緣及對側(cè)縱向取長約1.5 cm、寬0.3 cm 腸壁組織2 塊。蘇木精-伊紅染色，光鏡下判斷黏膜損傷，進(jìn)行損傷病理學(xué)分度。取病理學(xué)標(biāo)本后剩余結(jié)腸組織即刻放入凍存管置于液氮中保存。

1.6 結(jié)腸黏膜形態(tài)學(xué)評分方法 本文第一作者依據(jù)文獻(xiàn)［2］的方法進(jìn)行評分，為5 級評分(0 ～4 分)，其中0 分為黏膜無損傷，4 分為黏膜損傷程度最重。

1.7 結(jié)腸黏膜損傷病理學(xué)分度 由廣州市婦女兒童醫(yī)療中心病理科專人依據(jù)文獻(xiàn)［3］的方法進(jìn)行病理學(xué)分度，包括急性炎癥細(xì)胞浸潤、慢性炎癥細(xì)胞浸潤、絲素蛋白沉積、黏膜下層水腫、上皮細(xì)胞壞死和上皮組織潰瘍6 項(xiàng)，每項(xiàng)為2 級或3 級評分。

1.8 ELISA 測定結(jié)腸組織NFATC4 蛋白含量 按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.9 實(shí)時(shí)PCR 法檢測結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 表達(dá) 結(jié)腸組織提取總RNA 和合成cDNA，采用實(shí)時(shí)PCR 法檢測NFATC4 mRNA 表達(dá)，以β-actin 為內(nèi)參，引物見表1。目的基因的Ct 值與β-actin 的Ct 值的差值△Ct，以2－△Ct 作為相對含量進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)定量PCR 法擴(kuò)增曲線圖和熔解曲線見圖1。

表1 引物序列、循環(huán)條件、實(shí)時(shí)PCR 基因擴(kuò)增長度Tab 1 Sequences of primer，conditions of PCR and the length of product with real time PCR

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，方差齊性多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSK 法;方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS 對大鼠結(jié)腸形態(tài)學(xué)評分的影響 大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)肉眼評分為:假手術(shù)組0 分、IBD 模型組(5.67 ±0.87)分、APS 低劑量組(3.56 ±0.89)分、APS 高劑量組(1.56 ±0.53)分、地塞米松對照組(0.89 ± 0.78)分，組間差異總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.195 ，P=0.000)。與假手術(shù)組比較，IBD 模型組形態(tài)學(xué)評分顯著增高(P ＜0.001);與IBD 模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組形態(tài)學(xué)評分顯著降低(P 均＜0.001)。

圖1 實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 擴(kuò)增曲線圖和熔解曲線圖Fig 1 Diagrams of amplication cure and melting cure with real time PCR

2.2 APS 對結(jié)腸黏膜病理損傷的影響 病理學(xué)評分:假手術(shù)組(0.11 ± 0.08)分、IBD 模型組(5.67 ±1.15)分、APS低劑量組(3.33 ±0.58)、APS 高劑量組(1.33 ±1.15)分、地塞米松對照組(1.67 ±1.52)分，組間差異總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =13.34，P =0.001)。與假手術(shù)組比較，IBD 模型組病理學(xué)評分顯著提高(P ＜0.001);與IBD 模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組病理學(xué)評分顯著降低(P 均＜0.001)。組織病理學(xué)檢查顯示，假手術(shù)組可見正常的黏膜結(jié)構(gòu)(圖2A);IBD 模型組可見潰瘍，組織明顯水腫，出血，大量的炎性細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主(圖2B);APS 低劑量組潰瘍少見，組織輕度水腫，炎性細(xì)胞浸潤(圖2C);APS 高劑量組及地塞米松對照組見愈合的潰瘍組織，組織水腫及出血明顯減輕，炎性細(xì)胞明顯減少(圖2D 和E)。

圖2 各組大鼠光鏡下結(jié)腸黏膜所見(蘇木精-伊紅染色，×200)Fig 2 The colonic mucosal pathological pictures under the light microscope(HE stain，×200)

2.3 APS 對結(jié)腸組織NFATC4 表達(dá)的影響 如圖3A 所示，各組間結(jié)腸黏膜NFATC4 mRNA 的表達(dá)差異總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F =9.7，P =0.000)。與假手術(shù)組比較，IBD模型組NFATC4 mRNA 表達(dá)顯著增加(P =0.002);與IBD模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組NFATC4 mRNA 表達(dá)顯著增加(P 均＜0.001)。

2.4 APS 對結(jié)腸組織NFATC4 蛋白表達(dá)的影響 如圖3B所示，各組間結(jié)腸黏膜NFATC4 蛋白的表達(dá)差異總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.87，P=0.000)。與假手術(shù)組比較，IBD模型組NFATC4 蛋白表達(dá)無顯著變化(P =0.203);與IBD模型組比較，APS 高劑量組與地塞米松對照組NFATC4 蛋白表達(dá)顯著增加(P 均＜0.001)。

圖3 APS 對結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響Fig 3 The effect of APS on NFATC4 mRNA and protein expression in colon

3 討論

IBD 的發(fā)病機(jī)制可能與黏膜免疫系統(tǒng)激活、腸上皮黏膜屏障、炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生及遺傳易感性相關(guān)。腸上皮屏障損傷與修復(fù)貫穿于IBD 的整個過程，是IBD 發(fā)病機(jī)制中的中心環(huán)節(jié)［4］。因此，觀察腸黏膜的損傷、修復(fù)以及腸上皮細(xì)胞的增殖與分化，對研究腸上皮屏障功能及IBD 的治療有重要意義。TNBS 誘導(dǎo)的IBD 動物模型，其結(jié)腸組織學(xué)改變的許多特點(diǎn)與人類IBD 相似。該模型持續(xù)時(shí)間較長，慢性炎癥表現(xiàn)突出，體現(xiàn)急性炎癥向慢性轉(zhuǎn)化的動態(tài)過程，簡單易行，易于復(fù)制，為研究炎癥慢性化、探索藥物治療創(chuàng)造了條件。

黃芪中的有效成分APS 不僅對機(jī)體有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，還可誘導(dǎo)多種細(xì)胞增殖分化［5］、調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡。本研究從肉眼形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)，與IBD 模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組結(jié)腸形態(tài)學(xué)評分顯著降低，主要表現(xiàn)有上皮組織糜爛及潰瘍減少，組織水腫減輕。病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與IBD 模型組比較，APS 高劑量組、APS 低劑量組與地塞米松對照組的病理學(xué)評分顯著降低，主要表現(xiàn)為浸潤的急慢性炎癥細(xì)胞、壞死的上皮細(xì)胞及上皮組織形成潰瘍減少。因此，APS 有減少IBD 模型大鼠結(jié)腸組織的炎性細(xì)胞浸潤，修復(fù)受損的結(jié)腸黏膜，并促進(jìn)潰瘍愈合作用。

NFATs 是嚴(yán)格控制適應(yīng)性免疫T 細(xì)胞和B 細(xì)胞對促炎細(xì)胞因子表達(dá)的至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與T 細(xì)胞、B 細(xì)胞激活，趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡。隨著對NFATs 認(rèn)識的增多，發(fā)現(xiàn)其不僅表達(dá)于免疫系統(tǒng)，亦在食道和小腸上皮、心血管、腦、肺和脂肪等多種組織表達(dá)，可調(diào)控多種細(xì)胞的增殖與分化［6，7］。本課題組前期研究證實(shí)NFATC4 在K562 細(xì)胞中表達(dá);基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，APS 誘導(dǎo)后的NFATC4 表達(dá)倍數(shù)顯著增高，推測NFATC4 可能是APS 誘導(dǎo)K562 細(xì)胞增殖分化的重要的轉(zhuǎn)錄因子。本研究發(fā)現(xiàn):①正常結(jié)腸組織可表達(dá)NFATC4;②IBD 模型組結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 表達(dá)較假手術(shù)組增高，推測可能的原因是IBD 慢性炎癥啟動了機(jī)體對抗損傷黏膜的修復(fù)機(jī)制，NFATC4 mRNA 表達(dá)增加，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖與分化;③APS 干預(yù)后，APS 低劑量組與APS 高劑量組的NFATC4 mRNA 表達(dá)均比IBD 模型組顯著增高，表明APS 可誘導(dǎo)IBD 結(jié)腸組織NFATC4 mRNA 高表達(dá)，推測NFATC4 可能參與結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖分化的調(diào)控，以修復(fù)受損的腸屏障功能。在蛋白水平上，僅APS 高劑量組NFATC4 蛋白表達(dá)增加。NFATC4 對APS 調(diào)控結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖分化是否存在劑量依賴性，有待進(jìn)一步研究。

多味中藥組成的方劑是一個包含多種復(fù)雜化學(xué)成分的群體，通過多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)和多層次作用于人體發(fā)揮其治療作用，往往不能被一個或幾個模型和指標(biāo)所反映，導(dǎo)致難以進(jìn)行藥物作用機(jī)制的深入研究。而單味中藥及其有效成分的研究是方劑研究和深入進(jìn)行有效成分分離提取的前提，也是新藥研制必不可少的重要依據(jù)。本研究結(jié)果提示NFATC4 可能在APS 治療IBD 中起到分子靶點(diǎn)的作用，但APS 對IBD 維持和修復(fù)腸黏膜上皮的屏障功能、NFATC4表達(dá)調(diào)控、腸上皮細(xì)胞增殖與分化三者之間的相互作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的研究。

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