劉星綱 梅 芳 呂培軍 王新知

頜骨缺損的修復(fù)一直是口腔臨床上的難題之一。修復(fù)方法很多，自體骨和異體骨均存在自身難以克服的缺點(diǎn)。利用支架材料與種子細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建的人工骨被認(rèn)為是當(dāng)今骨缺損治療研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。 但是以往支架材料的構(gòu)建較多的使用強(qiáng)度大而降解性能差的材料[1]。近年來(lái)有學(xué)者嘗試使用降解性能更佳的β 磷酸三鈣修復(fù)骨缺損取得了良好的成骨效果[2]。我們與浙江大學(xué)合作研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的納米β-磷酸三鈣/膠原(Nβ-TCP/Co)在前期研究中證明降解性能雙向可調(diào)，具有良好的微觀結(jié)構(gòu)與宏觀可塑性，生物相容性較好[3]。本實(shí)驗(yàn)考慮采用NβTCP/Co作為載體，與兔自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymal stem cells,BMSCs)復(fù)合成人工骨，初步探討其修復(fù)骨缺損的效果，為骨組織工程支架材料的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 3－4月齡新西蘭大白兔兩只，北大醫(yī)學(xué)部動(dòng)物部提供并負(fù)責(zé)日常飼養(yǎng)。醫(yī)藥級(jí)甘氨酸由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供?；谇捌谠囼?yàn)結(jié)果，配成10g/L甘氨酸液，過(guò)濾除菌后備用[4]。NβTCP/Co是與浙江大學(xué)合作研發(fā)，主要成分是納米級(jí)β 相磷酸三鈣與I型膠原，重量比為2∶1，將材料制成直徑6mm，厚度1mm 的圓片，包裝后鈷60輻照消毒備用。DMEM/F12培養(yǎng)液由美國(guó)Hyclon公司提供。成骨誘導(dǎo)液成分為含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)液，10mmol/Lβ 甘油磷酸鈉，0.05mmol/L維生素C和100mm ol/L地塞米松。

1.2兔BMSCs的獲取、分離、傳代擴(kuò)增與成骨誘導(dǎo) 參照文獻(xiàn)，定位坐骨穿刺點(diǎn)[5]。兔常規(guī)備皮，消毒，全身麻醉后，在無(wú)菌條件下使用16號(hào)骨穿針在坐骨處穿刺，約得1m l左右紅色液體即拔出骨穿針，肝素抗凝，操作過(guò)程注意避免細(xì)菌污染。采用全骨髓培養(yǎng)法進(jìn)行原代培養(yǎng)。兔骨髓接種后20－48h根據(jù)細(xì)胞貼壁情況首次換液。以后每3－4d換液，細(xì)胞生長(zhǎng)匯合達(dá)到70－80%時(shí)胰酶加乙二胺四乙酸(Ethy lene Diam ine Tetraacetic Acid,EDTA)消化，1∶2傳代。

取上述3－4代細(xì)胞爬片，成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7天后取出，丙酮4℃固定30m in后取出，入堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)孵育液，未誘導(dǎo)細(xì)胞做為空白對(duì)照。

取上述3－4代細(xì)胞爬片，成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21天后取出，丙酮4℃固定30m in后，結(jié)節(jié)2%茜素紅染色。未誘導(dǎo)細(xì)胞做為空白對(duì)照。

1.3兔BMSCs與NβTCP/Co-復(fù)合物修復(fù)兔頜骨缺損 將獲得的兔BMSCs傳至第三代，EDTA＋胰酶消化后，用含有10g/L甘氨酸的DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107個(gè)/m l。根據(jù)前期研究成果，該濃度的甘氨酸既可有效拮抗人工骨制備過(guò)程中殘留的戊二醛的細(xì)胞毒性，又不明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。使種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合良好。用5m l無(wú)菌注射器吸取配置好的細(xì)胞懸液，小心滴加至人工骨表面，兩片人工骨共約滴加懸液0.5m l左右。每只動(dòng)物制備3片人工骨種子細(xì)胞復(fù)合體。放入24孔培養(yǎng)板用同種培養(yǎng)液培養(yǎng)3d后，取出一片吸干液體后滴加少量噻唑藍(lán)[(3-(4,5-dimethy lthiazol-2-y l)-2,5-dipheny ltetrazolium brom ide,MTT]，10m in后，觀察材料如果變?yōu)樗{(lán)色，提示有活細(xì)胞存在。則將剩余兩片人工骨種子細(xì)胞復(fù)合體做自體動(dòng)物回植。動(dòng)物分組采用自身對(duì)照方法，在兩只兔雙側(cè)下頜骨各制備10mm×8mm大小箱狀人工骨缺損，修整植入體外形以使其能夠嚴(yán)密充填骨缺損腔。實(shí)驗(yàn)側(cè)植入人工骨種子細(xì)胞復(fù)合體，對(duì)照側(cè)植入單純NβTCP/Co。10w 后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察成骨效果。

2.結(jié)果

2.1抽取的兔骨髓接種在培養(yǎng)皿內(nèi)即刻，見(jiàn)少許單核細(xì)胞，圓形，未貼壁(圖1a)。24h左右，可見(jiàn)少量細(xì)胞開(kāi)始貼壁，并伸展變形(圖1b)。之后細(xì)胞漸增多，呈梭狀(圖1c、d)。原代細(xì)胞培養(yǎng)14d左右可以進(jìn)行傳代。隨著傳代增加，細(xì)胞生長(zhǎng)速度漸漸加快，3-4代時(shí)，細(xì)胞同一性較好，生長(zhǎng)活躍；但當(dāng)傳至10代以后，生長(zhǎng)速度下降，出現(xiàn)老化現(xiàn)象。

圖1 兔紅骨髓倒置相差顯微鏡下圖像

2.2 ALP染色及茜素紅染色 成骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞ALP染色鏡下見(jiàn)棕黑色沉淀物，位于細(xì)胞內(nèi)。未誘導(dǎo)的細(xì)胞未見(jiàn)明顯黑色沉淀，ALP染色著色不明顯(見(jiàn)圖2)。2%茜素紅染色鏡下可見(jiàn)大量棕紅色鈣化結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)附著于培養(yǎng)板底壁，不能移動(dòng)(見(jiàn)圖3)?？梢?jiàn)成骨誘導(dǎo)后(a)大量棕黑色物質(zhì)位于細(xì)胞內(nèi)，未誘導(dǎo)細(xì)胞(b)未見(jiàn)明顯棕黑色沉淀物。

圖2 兔BMSCs3-4代細(xì)胞ALP染色鏡下圖像

圖3 兔BMSCs3-4代細(xì)胞2%茜素紅染色鏡下圖像。鏡下可見(jiàn)大量棕紅色鈣化結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)附著于培養(yǎng)板底壁，不能移動(dòng)。

圖4 10w時(shí)兔頜骨標(biāo)本。可見(jiàn)上方實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)骨較為光滑、連續(xù)，與周圍骨質(zhì)相似；下方對(duì)照側(cè)較多索條狀新生骨，與周圍骨質(zhì)區(qū)別明顯。

2.3頜骨標(biāo)本肉眼觀察 10w 時(shí)，骨缺損表面均已完全骨性修復(fù)，但實(shí)驗(yàn)側(cè)骨外形比對(duì)照側(cè)豐滿，表面骨皮質(zhì)比較光滑、連續(xù)。對(duì)照側(cè)骨缺損大部愈合，但表面骨皮質(zhì)仍有不連續(xù)處，原骨缺損區(qū)表面骨質(zhì)不光滑(圖4)。

2.4頜骨標(biāo)本組織切片觀察 兩側(cè)均可見(jiàn)原缺損區(qū)有骨質(zhì)出現(xiàn)，內(nèi)部均可見(jiàn)少量支架材料殘余。(圖5、圖6)。

圖5 10w時(shí)兔頜骨組織切片

圖6 10w時(shí)兔頜骨組織切片

3.討論

兔BMSCs與NβTCP/Co構(gòu)建的人工骨修復(fù)兔頜骨缺損，10w時(shí)骨外形比對(duì)照側(cè)豐滿，與周圍正常骨質(zhì)外形相似；而對(duì)照側(cè)尚有許多索條狀新生骨，外形與周圍骨質(zhì)差別明顯，處于骨改建過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)成骨的促進(jìn)作用。分析其原因可能為：具有一定濃度的BMSCs植入骨缺損區(qū)后可以向成骨細(xì)胞方向分化，從而保證早期就有充足的成骨細(xì)胞參與成骨，加速了成骨的過(guò)程，在相同時(shí)間內(nèi)成骨量要多于單純?nèi)斯す侵踩虢M。提示在臨床中β－磷酸三鈣/膠原與人自體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞復(fù)合后可以加速成骨過(guò)程。

鄂玲玲，劉洪臣等[6]曾在兔下頜牙槽骨制備10×4×3mm骨缺損，術(shù)后12w未見(jiàn)明顯新生骨形成，認(rèn)為其為一種極限骨缺損模型。Schm itz，JP[7]和Thomaidis，V[8]報(bào)道兔頜骨極限缺損的尺寸大于等5mm。因此，本實(shí)驗(yàn)所用骨缺損模型可認(rèn)為是一種極限骨缺損。在前期研究中，單純?chǔ)?磷酸三鈣/膠原復(fù)合體在12w時(shí)可以完全修復(fù)同類型兔頜骨缺損?；诒M量減少使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量的原則，我們選擇只在10w時(shí)觀察成骨效果，以便于較為敏感的觀察種子細(xì)胞的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用了口外入路的下頜骨中部箱型骨缺損模型，成骨影響因素相對(duì)較少，便于分析；不與口腔相通，便于無(wú)菌操作；需要時(shí)該模型也可以包含牙周組織。該處骨結(jié)構(gòu)與人下頜骨體部類似，為雙層皮質(zhì)骨，內(nèi)為松質(zhì)骨，且含有牙周結(jié)構(gòu)。去除頰面皮質(zhì)骨后很容易制備成箱型植骨床，易于填充缺損區(qū)，且不需要輔助固位技術(shù)，影響成骨的因素除植骨材料外相對(duì)較少,易于檢驗(yàn)人工骨的效果。兔下頜骨缺損的具體位置有不同報(bào)道，2002年胡秀蓮，林野等[9]采用位于下頜角，相當(dāng)于升支處的洞穿型骨缺損，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該處5mm×5mm洞穿骨缺損無(wú)法自愈，使用可吸收膜后成骨也欠理想。推測(cè)其原因可能為該處骨質(zhì)菲薄，為厚度不足0.5mm的皮質(zhì)骨，且兩邊為強(qiáng)大的咀嚼肌，難以形成足夠的植骨間隙。我們前期的實(shí)驗(yàn)也證明采用該種缺損模型成骨量較少，難以定量分析，且成骨效果不穩(wěn)定[10]。

對(duì)于骨組織工程的最適種子細(xì)胞濃度目前不同學(xué)者間尚未達(dá)成共識(shí)[11-13]。大量高密度種子細(xì)胞的接種對(duì)于構(gòu)建組織的結(jié)構(gòu)維持與功能發(fā)揮是至關(guān)重要的[14]，但是種子細(xì)胞接種密度也不是越高越好。密度過(guò)高會(huì)造成細(xì)胞的過(guò)度堆積，營(yíng)養(yǎng)供給不良導(dǎo)致過(guò)量細(xì)胞死亡，造成種子細(xì)胞的浪費(fèi)。這一點(diǎn)在較大體積骨缺損的修復(fù)中尤其重要。同時(shí)也要考慮生物材料吸水性的不同而調(diào)整細(xì)胞密度。比如同體積的聚乳酸與殼聚糖生物材料，因聚乳酸吸水性較好，如果接種時(shí)細(xì)胞懸液的濃度相同，必然會(huì)造成聚乳酸因吸收較多的液體而在相同體積的材料內(nèi)容納了較多的細(xì)胞，此時(shí)可以將細(xì)胞懸液的濃度適當(dāng)較低一些。有研究證明，單位重量脫鈣骨對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的最大黏附數(shù)量為3.5×107/g，接種細(xì)胞濃度在5×105/m l時(shí)黏附率最高[15]。這可以作為一個(gè)參考的基準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)選擇的種子細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/m l，是綜合考慮能夠獲得的種子細(xì)胞數(shù)量，所用支架材料的性能，以及頜骨良好的血供。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該濃度的種子細(xì)胞顯示出良好的促進(jìn)骨愈合的作用。

3－4代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)后，鈣化結(jié)節(jié)及ALP染色與誘導(dǎo)前比較明顯增強(qiáng)，提示獲取的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞方向分化，可以用于體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)。該結(jié)果與其他學(xué)者研究結(jié)果相同[16,17]。

文獻(xiàn)報(bào)道的兔骨髓穿刺的部位可以有股骨、脛骨、髂骨及坐骨。采用股骨等長(zhǎng)骨部位的實(shí)驗(yàn)較多，髂骨也有報(bào)道，坐骨少見(jiàn)。在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，髂骨是可以提取出骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的，但是因?yàn)轺墓禽^薄，操作過(guò)程中落空感不明顯，骨穿針較易穿透整個(gè)髂骨造成失敗。而坐骨不僅同為不規(guī)則骨，且較髂骨為厚，并且有可以體表定位的骨性解剖標(biāo)志，選擇坐骨做為骨髓穿刺的位置，針刺時(shí)落空感明顯，可抽取所需的骨髓量，最終結(jié)果證實(shí)取材滿意，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。因此坐骨是較好的兔骨髓穿刺部位。

Nβ-TCP/Co結(jié)合兔BMSCs對(duì)于更大骨缺損修復(fù)能力尚有待檢驗(yàn)。

綜上所述，兔BMSCs與Nβ-TCP/Co結(jié)合后回植入兔頜骨人工骨缺損區(qū)后，可以良好成骨，成骨較單純納米β-磷酸三鈣/膠原復(fù)合體好。

[1] 朱建華，馬珊珊，李慕勤，等.新型骨支架復(fù)合材料修復(fù)牙槽骨缺損研究[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2012(8)：767-771

[2] 楊世茂，王明國(guó)，李 靜，等.復(fù)合ADSCs/β-TCP組織工程骨與PRF修復(fù)下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012(6)：686-690

[3] Zou C,WengW,Deng X,etal.Preparation and characterization of porous beta-tricalcium phosphate/collagen compositeswith an integrated structure[J].Biomaterials,2005，26(26)：5276-5284

[4] 劉星綱，鄧旭亮，梅 芳，等.甘氨酸對(duì)新型膠原基人工骨材料細(xì)胞毒性影響的體外研究[J].北京口腔醫(yī)學(xué)，2007(2)：78-80

[5] 劉丹平，胡蘊(yùn)玉，施新猷，等.穿刺抽取兔骨髓的方法[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000(6)：741-744

[6] 鄂玲玲，王東勝，師占平，等.一種新型的兔牙槽骨缺損模型的建立[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，9(3)：137-140，171

[7] Schm itz J P,Hollinger J O.The critical size defect as an experimentalmodel for craniomandibulofacial nonunions[J].Clin Orthop RelatRes，1986(205)：299-308

[8] ThomaidisV,Kazakos K,LyrasDN,etal.Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size[J].Med Sci Monit,2008，14(4)：R67-R73

[9] 胡秀蓮，邱立新，林 野，等.可吸收性Bio-Gide膜治療下頜角區(qū)局部骨缺損實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)口腔種植學(xué)雜志，2002(1)：10-12

[10]劉星綱，翁文劍，鄧旭亮，等.納米β-磷酸三鈣/膠原復(fù)合體修復(fù)兔頜骨缺損的研究[J].口腔醫(yī)學(xué)，2005(4)：196-197

[11]李春明，楊春艷，劉寶林，等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞復(fù)合多孔礦化Bio-Oss骨膠原移植修復(fù)下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005(3)：352-355

[12]李 智，李祖兵.骨髓來(lái)源成骨細(xì)胞復(fù)合脫鈣骨修復(fù)頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005(5)：83

[13]袁 捷，祝 聯(lián)，王 敏，等.自體骨髓基質(zhì)干細(xì)胞-珊瑚羥基磷灰石修復(fù)下頜骨節(jié)段缺損的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2006(2)：94-97

[14]組織工程學(xué)理論與實(shí)踐[M].上海科學(xué)技術(shù)出版社，2004.360

[15]柴 崗，張 艷，王 敏，等.人骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和脫鈣骨粘附率的研究[J].實(shí)用美容整形外科雜志，2003(2)：66-69

[16]陳小菊，王 嫣，王 蘭，等.誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009(10)：1185-1187.

[17]田少奇，王 麗，孫 康，等.人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其多向分化潛能的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)骨與關(guān)節(jié)損傷雜志，2009(2)：108-111