張國強，田亞平

江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫214122

蛋白酶四大家族［1-4］，即天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶，通過特異性地水解不同的肽鍵控制著生物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成后的結(jié)構(gòu)修飾與功能釋放，來規(guī)范生物體的生理活動，例如參與消化的胃蛋白酶、調(diào)控血壓的腎素、參與細胞內(nèi)肽水解的組織蛋白酶D、水解酪蛋白的凝乳酶、艾滋病病毒蛋白酶等［5，6］。研究天冬氨酸蛋白酶的抑制劑作為高血壓、病毒傳染、腫瘤轉(zhuǎn)移、大腦進行性萎縮(Alzheimer＇s disease)等疾病的治療方案有較高的醫(yī)療學價值［7，8］。天冬氨酸蛋白酶抑制劑還可作為純生啤酒、面粉加工等的品質(zhì)改良劑。

大豆蛋白在大豆中含量38%左右，是谷類食物的4～5倍［9］。降解大豆蛋白有多種方法，每種方法獲得的肽段的種類及組成不盡相同。目前，主要采用化學水解法、酶解法、和微生物發(fā)酵的方法獲得活性多肽［10］，其研究成果集中在ACE活性抑制肽、抗氧化肽、降膽固醇肽、調(diào)節(jié)免疫肽等方面。吳建平［11］等通過蛋白酶酶解大豆豆粕獲得了兩種ACE抑制肽;鐘芳［12］等通過兩種蛋白酶AS1.398和Alcalase水解大豆分離蛋白制得水解度為10%～24%的大豆多肽，通過大孔樹脂以及凝膠層析獲得了3個ACE抑制劑峰。

本文采用可控酶解大豆蛋白的方式獲得一種小分子肽類天冬氨酸蛋白酶抑制劑，原料純天然，來源廣泛、酶解條件安全溫和、工藝易于規(guī)?；糯?，目標產(chǎn)品在醫(yī)藥保健和食品品質(zhì)提升方面有較大的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大豆分離蛋白，購自安陽漫天雪食品有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶購自美國sigma公司;風味蛋白酶購自諾維信公司;DEAE-52，美國Amersham公司;AKTA純化系統(tǒng)，GE Healthcare醫(yī)療集團;高速冷凍離心機、真空冷凍干燥機，日本日立公司;MOS-450 AF-CD圓二色光譜儀，法國Bio-Logic SAS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶活性、酶解產(chǎn)物抑制活性測定

蛋白酶活力測定:福林酚法。

抑制活性測定:對蛋白酶的抑制活性是通過測定在酶最適pH條件下抑制組(加入抑制劑)與空白組(加入緩沖液)底物水解度差異來進行的。空白組為正常的酶解反應(yīng)，預反應(yīng)時只加入與溶解抑制劑相同的緩沖液。

抑制活性的定義:即為抑制組與空白組所測得蛋白酶活力的差異百分數(shù)，10%為一個抑制單位，用IU表示。

1.2.2 可控酶解條件

配置濃度為5%的蛋白底物，酶加入量為8000 U/g，分別用木瓜蛋白酶(50℃)、胰蛋白酶(37℃)、風味蛋白酶(37℃，酸式水解、堿式水解)，在其最適條件下單酶水解大豆蛋白，在0～90 min內(nèi)每隔10 min取樣，樣品立即在90℃滅酶活15 min，恢復至室溫后測定對胃蛋白酶抑制活性。

1.2.3 抑制劑的分離純化

酶解液90℃熱處理15 min，離心除去析出的不溶蛋白，凍干備用。

DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析:用pH 6.8的磷酸鈉緩沖液(20 mmol/L)溶解凍干樣品，用pH 6.8的磷酸鈉緩沖液(20 mmol/L)，在流速為5 mL/min條件下平衡HiPrep DEAE FF 16/10 (1.6×10 cm)柱，收集未吸收峰，再分別以含Nacl濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 M的磷酸鈉緩沖液進行梯度洗脫。

Superdex Peptide 10/300 GL凝膠層析:用 pH 6.8的磷酸鈉緩沖液平衡色譜柱。進樣量為0.2 mL，以同樣的緩沖液洗脫，流速為0.1 mL/min，檢測波長為220 nm。

SOURCE 15RPC反相層析:SOURCE 15RPC ST4.6/100色譜柱，流動相:A，10%乙腈(V/V)，0.1%三氟乙酸(TFA)(V/V);B，80%乙腈(V/V)，0.1%三氟乙酸(TFA)(V/V)，線性洗脫，檢測波長為220 nm。

1.2.4 純度鑒定

用RP-HPLC法測定反相層析獲得的樣品的純度。取凍干后的樣品用雙蒸水溶解后用0.22 μm微孔濾膜過濾。色譜條件:Restek C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:A，20%乙腈(V/V)，0.1%三氯乙酸(V/V);B，70%乙腈(V/V)，0.1%三氯乙酸(V/V)。梯度洗脫程序:0～3 min 100%A (V/V)，5～20 min:0～100%B(V/V)。流速為1 mL/min;柱溫為25°C，進樣量為10 μL;檢測波長為220 nm。

1.2.5 SAPI的基本性質(zhì)研究

溫度穩(wěn)定性的研究:在溫度范圍20～90℃內(nèi)，每增加10℃為一個梯度，水浴1 h，之后恢復至室溫，測定抑制劑對胃蛋白酶的剩余抑制活性，確定抑制劑溫度穩(wěn)定性。

抑制酶譜的確定:分別測定酶解產(chǎn)物對胃蛋白酶(Pepsin，天冬氨酸族蛋白酶)、凝乳酶(Chymosin，天冬氨酸族蛋白酶)、木瓜蛋白酶(Papain，巰基蛋白酶)、胰蛋白酶(Trypsin，賴氨酸、精氨酸酶)、中性蛋白酶(Neutral protease)和堿性蛋白酶(Alkaline protease)的抑制活性，確定抑制劑的抑制酶譜。

抑制劑對胃蛋白酶的IC50測定:在最佳條件下，測定不同的抑制劑濃度對胃蛋白酶活性的抑制百分比，以抑制劑濃度為橫坐標，胃蛋白酶損失的酶活單位為縱坐標，作圖法確定抑制劑對胃蛋白酶的半數(shù)抑制濃度。

抑制劑抑制動力學分析:固定胃蛋白酶質(zhì)量濃度為1 mg/mL，改變底物濃度以及抑制劑加入量，測定反應(yīng)初速度。以血紅蛋白濃度為橫坐標，胃蛋白酶反應(yīng)初速率為縱坐標，研究不同抑制劑濃度對酶活的影響。以底物濃度倒數(shù)為橫坐標，以反應(yīng)初速度為縱坐標，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，測定抑制劑抑制類型。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆分離蛋白可控酶解條件

如圖1所示，木瓜蛋白酶水解大豆分離蛋白，在水解30 min時獲得最大對胃蛋白酶抑制活性，為3.3 IU/mL。30 min后繼續(xù)酶解，抑制活性無明顯增加。取木瓜蛋白酶水解30 min后的酶解液，分別用胰蛋白酶，風味蛋白酶(酸式與堿式)繼續(xù)酶解，酶解時間為60 min，酶解后抑制活性幾乎沒有變化，因此明確可控酶解條件為:大豆分離蛋白85℃水浴20 min，恢復至木瓜蛋白酶最適溫度后以酶底比為8000 U/g的加入量酶解30 min。

圖1 單酶水解大豆蛋白Fig.1 Production of inhibitor from soy protain by single enzyme hydrolysis

2.2 抑制劑的分離純化

木瓜蛋白酶酶解30min的酶解液90℃水浴15 min滅酶，冷凍離心去除析出變性蛋白質(zhì)后凍干，備用。

2.2.1 DEAE-52陰離子交換層析

酶解后的凍干樣品，通過DEAE-52陰離子交換層析，結(jié)果見圖2，在以0.2M Nacl進行洗脫時獲得了具有較高抑制活性的組分，收集活性峰處樣品，冷凍干燥，即為粗抑制劑。

圖2 DEAE-52離子交換層析圖譜Fig.2 Ion-exchange chromatography by DEAE-52

2.2.2 Superdex Peptide 10/300 GL凝膠層析

將上一步獲得的粗抑制劑進行凝膠層析，結(jié)果見圖3，在峰a處檢測到了高抑制活性的組分，但是相應(yīng)的電導率峰a也達到了最大值，在凝膠層析過程中，活性組分與鹽分同時洗脫出來，說明活性組分分子量可能比較小，后續(xù)分離步驟嘗試采用反相層析的方法。

圖3 Superdex Peptide 10/300 GL凝膠層析ig.3 Superdex Peptide 10/300 GL gel chromatography

2.2.3 SOURCE 15RPC反相層析

將凝膠層析的結(jié)果進行反相層析，結(jié)果見圖4，在峰a處測得了樣品具有對胃蛋白酶抑制活性。在0～10 min內(nèi)洗脫下來的是未吸附于層析柱上的組分，且在峰a處測得了較大的電導率，說明活性組分仍然與鹽分一并洗脫下來。表1為木瓜蛋白酶酶解大豆蛋白獲得抑制劑的分離、純化過程的比抑制活性及活力的變化情況。最終比抑制活力為254.2 IU/mg，純化倍數(shù)為62。

圖4 SOURCE 15RPC反相層析Fig.4 SOURCE 15RPC reverse phase chromatography

表1 純化結(jié)果Table 1 Purification results

2.2.4 抑制劑純度鑒定(多肽分布)

圖5 反相層析純化后多肽分布Fig.5 Polypeptide molecular weight distribution after reverse phase chromatography

測定反相層析后獲得樣品的多肽分布，結(jié)果見圖5。經(jīng)過反相層析的樣品，大分子量的雜蛋白已經(jīng)基本去除，分子量為62的吸收峰為樣品中的鹽分，分子量為167的最為可能是目的組分，從分子量上推測可能是含2個氨基酸的小肽。結(jié)合等電點測定在pH 4～5之間及其在離子交換層析過程的表現(xiàn)，說明其中必定含有一種酸性氨基酸。

2.3 SAPI的基本性質(zhì)研究

2.3.1 抑制劑熱穩(wěn)定性試驗

結(jié)果見圖6，在20～90℃范圍內(nèi)，獲得大豆蛋白酶解產(chǎn)物(胃蛋白酶抑制劑)具有良好的熱穩(wěn)定性，因此其應(yīng)用范圍更廣，且對加工、保存皆有較大益處。

圖6 SAPI的溫度穩(wěn)定性Fig.6 The heat stability of SAPI

2.3.2 抑制劑的抑制酶譜的研究

如圖7，SAPI對天冬氨酸家族的胃蛋白酶以及凝乳酶具有較高抑制活性，對其它家族的蛋白酶幾乎沒有抑制效果，可明確該小分子抑制劑為一種天冬氨酸族蛋白酶抑制劑。

2.3.3 SAPI對胃蛋白酶的IC50測定

結(jié)果見圖8，SAPI的濃度與抑制率并不成線性關(guān)系，當抑制率達到50%時，其對應(yīng)的半抑制濃度約為25.67 μg/mL，從靈芝發(fā)酵干粉［13］中提取的抑制劑對胃蛋白酶的IC50為180 μg/mL，在植物中提取的抑制劑中抑制劑的IC50值已屬于抑制作用較強的類型。

2.3.4 抑制劑對胃蛋白酶的抑制動力學研究

Lineweaver-Bunk雙倒數(shù)法作圖，結(jié)果見圖9、10。由圖可知，抑制劑加入后沒有影響胃蛋白酶的Km值，同時Vm值減小，說明抑制劑屬于非競爭性的，由于抑制劑分子量較小，推測抑制劑可以與胃蛋白酶分子多處相互作用。

3 結(jié)語

大豆蛋白熱處理后經(jīng)木瓜蛋白酶在特定條件下酶解，可獲得較高抑制活性的酶解產(chǎn)物。經(jīng)過DEAE-52陰離子交換、Superdex Peptide 10/300 GL凝膠層析、SOURCE 15RPC反相層析獲得了62倍純化的天冬氨酸蛋白酶抑制劑，屬于一種非競爭性抑制劑。酶解大豆蛋白獲得的天冬氨酸蛋白酶抑制劑SAPI符合具有藥用潛力蛋白酶抑制劑的特點:天然產(chǎn)物、易于獲得、分子量較小(＜1000 Da)、具有良好的溫度穩(wěn)定性。

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