趙海清，竇 君，楊春燕，阿吉艾克拜爾·艾薩

中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011

隨著環(huán)境因素和行為模式的改變，糖尿病已經(jīng)成為我國(guó)主要公共健康問題。2型糖尿病主要特征是胰島素抵抗。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase1B，PTP1B)是PTPase家族成員之一，被認(rèn)為是胰島素和瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對(duì)2型糖尿病和肥胖癥的發(fā)生、發(fā)展有重要的負(fù)調(diào)控作用，近年來成為治療2型糖尿病等胰島素抵抗相關(guān)疾病的新靶點(diǎn)［1-3］。在嚙齒類動(dòng)物和具有胰島素抵抗肥胖人群的脂肪及骨骼肌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)和酶活性均處于較高水平，揭示PTP1B可能在胰島素抵抗的病理過程中具有重要的生理功能［4，5］。抑制PTP1B活性，可導(dǎo)致脂肪、肝臟和肌肉組織中胰島素受體和胰島素受體底物蛋白的磷酸化水平增強(qiáng)，提高下游通路中信號(hào)分子以及最終糖原合成，從而增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高胰島素敏感性。因此，有效的PTP1B抑制劑可能成為一類新型的胰島素增敏劑應(yīng)用于2型糖尿病和肥胖癥的治療。

黃芪屬豆科植物，藥用植物資源非常豐富，其中蒙古黃芪是常用的補(bǔ)氣固表中藥，臨床上廣泛應(yīng)用于心、腦血管疾病以及糖尿病的輔助治療及抗腫瘤、保肝。相關(guān)的化學(xué)成分研究主要集中于蒙古黃芪、膜莢黃芪［6］，從中分離鑒定的山奈酚、槲皮素、異鼠李素、鼠李檸檬素、熊竹素等黃酮類化合及黃芪皂苷、大豆皂苷等皂苷類化合物，表現(xiàn)出豐富的化學(xué)多樣性。阿勒泰黃芪(Astragalus altaicus Bge)是維藥常用藥材，具有補(bǔ)氣固表、托瘡生肌、治體虛自汗、利尿消腫等功效，相關(guān)研究較少。程杰飛等［7］對(duì)阿爾泰黃芪的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，但沒有涉及其藥理作用。本研究應(yīng)用本室所建立的PTP1B體外篩選模型，對(duì)阿勒泰黃芪提取物進(jìn)行活性測(cè)定，初步證明其具有較強(qiáng)的PTP1B抑制活性，為進(jìn)一步開發(fā)該藥用植物資源提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

實(shí)驗(yàn)所用PTP1B為本實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)、提取純化。pNPP(對(duì)-硝基苯磷酸二鈉)為Sigma產(chǎn)品，IPTG、卡那霉素、Hepes為Merck產(chǎn)品，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清為Invitrogen公司產(chǎn)品，葡萄糖測(cè)定試劑盒為北京普利萊基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY92-ⅡD(寧波新芝生物科技股份有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(Beckman，美國(guó))，酶標(biāo)儀(SpectraMax M5，美國(guó))，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。CHO-K1(倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。黃芪采自新疆阿勒泰地區(qū)布爾津縣，并由中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所植物專家沈冠冕鑒定。

1.2 阿勒泰黃芪提取物制備

阿勒泰黃芪經(jīng)粉碎后，用甲醇提取，再用氯仿萃取，經(jīng)過大孔樹脂，用乙醇洗脫，濃縮干燥備用。

1.3 阿勒泰黃芪提取物黃酮、皂苷含量測(cè)定

參考《保健食品功效成分檢測(cè)方法》［8］，測(cè)定提取物中黃酮、皂苷含量。

1.4 蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP-1B的純化及活性測(cè)定

將含pET-30a-PTP1B1-321的大腸桿菌BL21進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)0.4 mmol/LIPTG誘導(dǎo)3.5-4.0 h，6000 r/ min離心6 min，收集菌體，冰浴超聲破碎，4℃，12000 rpm離心10 min，取上清上Ni2+親和層析柱，充分結(jié)合，用50和100 mmol/L的咪唑洗脫，4℃過夜輕微攪拌透析，再濃縮后備用。用微量法測(cè)定所獲重組PTP1B的活性。測(cè)定反應(yīng)體系:5 mmol/L pNPP，0.09 μmol/L his-PTP1B1-321，緩沖液(包括20 mmol/L HEPES，150 mmol/LNaCl和1 mmol/L EDTA(pH 7.0))，總體積為200 μL。室溫孵育 10 min，再加入pNPP，室溫孵育30 min后，用3 mol/L NaOH終止反應(yīng)。在405 nm處測(cè)定吸收值，以不含酶溶液體系為空白。

1.5 提取物對(duì)PTP1B活性抑制作用的測(cè)定

1.5.1 IC50值的確定

按上述活性測(cè)定方法，提取物用DMSO溶解，按不同劑量加入，405 nm處測(cè)定吸收值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。按抑制率 =(OD405空白-OD405樣品)/ OD405空白×100%，求得不同濃度的抑制率。應(yīng)用Origin軟件計(jì)算IC50值。

1.5.2 抑制類型的確定

調(diào)整底物濃度，測(cè)定反應(yīng)的速度，取均值利用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk plots)確定抑制類型。

1.6 葡萄糖含量的測(cè)定

培養(yǎng)CHO細(xì)胞24 h后，按50 μg/mL的濃度分別添加不同的提取物，作用24 h后，收集培養(yǎng)液，依試劑盒操作說明測(cè)定葡萄糖含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用雙倒數(shù)作圖法確定抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的抑制類型。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)抑制類型的不同，應(yīng)用不同的作圖求Ki值，即(1)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，則用Dixon作圖法(以抑制劑的濃度對(duì)反應(yīng)速度的倒數(shù)作圖)求Ki;(2)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制，Cornish-Bowden作圖法(以抑制劑濃度對(duì)反應(yīng)速度的倒數(shù)作圖)求Ki;(3)混合型抑制有兩個(gè)抑制常數(shù)Ki，Ki'，所以用Dixon作圖法求Ki，同時(shí)用Cornish-Bowden作圖法求得抑制常數(shù)Ki'。

2 結(jié)果

2.1 黃芪提取物中黃酮、皂苷含量

8種提取物(E1～8)中黃酮含量分別為5.09、10.46、3.58、3.23、53.91、21.77、5.76和7.49 mg/ mL，E1、E2、E6、E7和E8皂苷含量分別為16.53、27.45、21.9、10.21和8.96 mg/mL，其余提取物中未檢測(cè)到皂苷。

2.2 黃芪提取物對(duì)PTP1B活性的影響

以pNPP為底物，NaVO3作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定his-PTP1B1-321的活性。用DMSO溶解種不同的阿勒泰黃芪提取物(E1～8)，配成不同濃度，按上述方法檢測(cè)其對(duì)PTP1B抑制作用。結(jié)果顯示，E3、E4、E5和E6對(duì)PTP1B的作用不明顯;E1、E2、E7、E8對(duì)PTP1B具有較強(qiáng)的抑制活性，IC50分別為34.8、4.7、7.35和7.15 μg/mL。

2.3 黃芪提取物對(duì)PTP1B抑制作用的動(dòng)力學(xué)分析

4種有活性提取物對(duì)his-PTP1B1-321抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比較，阿勒泰黃芪提取物1、7和8可使表觀Km值增大，但不影響PTP1B的Vmax，雙倒數(shù)作圖后，與空白對(duì)照組的直線相交于縱軸，提示其對(duì)PTP1B的抑制作用類型屬于競(jìng)爭(zhēng)性(圖1、圖3和圖4)。阿勒泰黃芪提取物2在雙倒數(shù)作圖時(shí)，直線的交點(diǎn)并不交在1/［S］軸或1/v軸上，而是相交于第II象限，表現(xiàn)出混合型抑制;應(yīng)用Dixon作圖法，求出E2的Ki為0.177，另外，采用Cornish-Bowden作圖法求另一抑制常數(shù)Ki'為0.134，表現(xiàn)出Ki＞Ki'，提示其抑制作用類型為混合型中的競(jìng)爭(zhēng)性抑制(圖2)。

圖1 阿勒泰黃芪提取物1對(duì)PTP1B抑制作用類型測(cè)定Fig.1 Determination of the inhibitory mode of extract 1 of A.altaicuson PTP1B

2.4 對(duì)葡萄糖利用的影響

在相同的濃度下，不同的提取物對(duì)CHO細(xì)胞利用葡萄糖的能力不同。提取物1、2、5、7和8較明顯提高CHO細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用。提取物3、4和6對(duì)CHO細(xì)胞利用葡萄糖的能力影響不明顯。

阿勒泰黃芪提取物對(duì)CHO細(xì)胞利用葡萄糖的影響Fig.5 Effect of extracts of A.altaicuson the rate of glucose in CHO cells

3 討論

由于2型糖尿病的發(fā)生與β產(chǎn)生胰島素、血液循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)送胰島素以及胰島素作用靶細(xì)胞并發(fā)揮生理作用密切相關(guān)，與之相關(guān)的酶靶，就成了2型糖尿病藥物開發(fā)的靶標(biāo)［9］，同時(shí)已成為降低糖尿病發(fā)病率的重要防治策略。目前蛋白酪氨酸磷酸酶作為負(fù)性調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵酶，對(duì)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展有著重要的意義。PTP1B的活性和/或表達(dá)過度升高，可下調(diào)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制葡萄糖的攝取和糖原合成，導(dǎo)致胰島素抵抗和糖尿病狀態(tài)。

從天然植物，特別是具有藥用背景的植物中分離PTP1B抑制劑是目前研究的熱點(diǎn)［10］。維醫(yī)藥在2型糖尿病治療方面具有較好的效果，已針對(duì)不同的靶點(diǎn)(如醛糖還原酶，α-葡萄糖苷酶等)，篩選出許多相關(guān)的天然抑制劑［11，12］。本研究比較維藥阿勒泰黃芪不同提取物的PTP1B抑制活性，發(fā)現(xiàn)4種組分對(duì)PTP1B有好的抑制作用，具有不同的抑制類型。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)活性組分能有效提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用度。但是，PTP1B抑制活性的強(qiáng)弱與對(duì)葡萄糖利用度的影響不成正相關(guān)，提示阿勒泰黃芪除了通過PTP1B途徑降糖外，可能還存在其它的降糖方式。

黃酮類化合物的藥理活性有大量報(bào)道，已證實(shí)具有降糖、降脂、改善胰島素抵抗的作用。為此，我們研究了黃酮、皂苷的含量與PTP1B抑制活性的關(guān)系，初步推測(cè)阿勒泰黃芪中皂苷可能是主要的活性物質(zhì)，將為后續(xù)的活性化合物的分離提供指導(dǎo)。本研究結(jié)果將為我們以活性跟蹤法從植物藥中篩選靶向性強(qiáng)、高效低毒的天然抑制劑提供了新的思路，并為開發(fā)為防治糖尿病及改善胰島素抵抗的藥物或保健品提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Zhang ZY.Protein tyrosine phosphatases:structure and function，substrate specificity，and inhibitor development.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2002，42:209-234.

2 Tonks NK.PTP1 B:from the sidelines to the front lines.FEBS Lett，2003，546:140-148.

3 Ramachandran C，Kennedy BP.Protein tyrosine phosphatase1B:a novel target for type 2 diabetes and obesity.Curr Top Med Chem，2003，3:749-757.

4 Ahmad F，Azevedo JL，Cortright R，et al.Alteration in skeletalmuscleprotein-tyrosinephosphataseactivityand expressionininsulin-resistanthumanobesityanddiabetes.J Clin Invest，1997，100:449-458.

5 Ahmad F，Considine RV，Bauer TL，et al.Improved sensitivitytoinsulininobesesubjectsfollowingweightlossis accompanied by reduced protein-tyrosine phosphatases in adiposetissue.Metabolism，1997，46:1140-1145.

6 Su YL(蘇彥雷).Research progress on Astragali mongholicus.J Strait Pharm(海峽藥學(xué))，2009，12:1-4.

7 Cheng JF(程杰飛)，Wu JF(吳劍飛)，Aziguli(阿茲古麗)，et al.Study on chemical constituents from the Astragalus altaicus.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，1994，25:563-564.

8 Wang GY(王光亞).The detection method of functional component in health food(保健食品功效成分檢測(cè)方法).Beijing:Chinese light industry press，2002:133.

9 Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China.N Engl J Med，2010，362:1090-1101.

10 Cui L，Ndinteh DT，Na M，et al.Isoprenylated flavonoids from the stem bark of Erythrina abyssinica.J Nat Prod，2007，70: 1039-1042.

11 Aihemait W(吾布力哈斯木·艾合買提)，Shademhanmd D (迪利夏提·沙德穆罕默德).Clinical observation on 172 cases suffered from diabetes mellitus treated by Uigurian medicine.J Med Pharm Chin Minor(中國(guó)民族醫(yī)藥雜志)，2000，6:8-9.

12 Wang YQ(王玉芹)，Chen N(陳娜)，Aisa HA(阿吉艾克拜爾·艾薩)，et al.Effect of reducing plasmas glucose of active fractions and chickpea of Uygur medicine.Chin Tradit Patent Med(中成藥)，2007，29:1832-1834.