閔文傲， 王衛(wèi)平， 袁軍華， 陳建榮

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

血紅蛋白(Hb，hemoglobin)是血液中運(yùn)輸氧氣的主要物質(zhì)，因其結(jié)構(gòu)確定、分布廣泛，一直是研究血紅素類(lèi)蛋白質(zhì)直接電化學(xué)及生物傳感和電催化的理想模型．Hb直接電化學(xué)的研究會(huì)遇到電活性中心難以暴露、電子傳輸緩慢等難題，目前常用蛋白質(zhì)膜技術(shù)形成適宜的蛋白-電極界面以加強(qiáng)Hb的電子轉(zhuǎn)移，如：Hb-生物模擬膜界面［1-4］、Hb-納米粒子界面［5-7］、Hb-聚合物膜界面［8］等，這些界面不僅能為Hb提供一個(gè)類(lèi)似于其生物膜的微環(huán)境，保持其自然結(jié)構(gòu)和生物活性，而且能阻止雜質(zhì)及Hb變性吸附引起的電極鈍化，加速Hb與電極之間直接、可逆的電子交換反應(yīng)．文獻(xiàn)［9］用雞蛋卵磷脂包埋固定Hb于玻碳電極表面，在形成的界面上可以得到Hb可逆的氧化還原峰．

戊二醛(GA，glutaraldehyde)是一種理想的交聯(lián)試劑，可以與Hb的多種氨基酸殘基發(fā)生非特異性反應(yīng)，使Hb形成聚合物，但不影響Hb的生物活性．文獻(xiàn)［10］用GA作交聯(lián)劑，將Hb偶聯(lián)到熱解石墨電極表面．GA不僅增強(qiáng)了Hb的剛性結(jié)構(gòu)，保持了蛋白質(zhì)的自身特性，而且當(dāng)其吸附在電極表面時(shí)又避免了Hb的變性，因此可容易地實(shí)現(xiàn)電極上的直接電子轉(zhuǎn)移．文獻(xiàn)［11］將GA交聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶納米粒子直接固定在金電極表面，促進(jìn)了辣根過(guò)氧化物酶在金電極上的電子轉(zhuǎn)移．文獻(xiàn)［12］用GA作為手臂分子偶聯(lián)的方法將氨基酸修飾到金電極上，并以該修飾電極為工作電極，利用方波伏安法對(duì)痕量銅離子進(jìn)行了檢測(cè)．

氨茶堿是廣譜的平喘藥物，可松弛支氣管平滑肌，也能松弛腸道、膽道等多種平滑肌，對(duì)支氣管粘膜的充血、水腫有緩解作用［13］．但因其安全性范圍較小，常需進(jìn)行臨床藥物監(jiān)測(cè)．已報(bào)道的研究氨茶堿與蛋白質(zhì)相互作用的方法有熒光光譜法［14］和高效液相色譜(HPLC)法［15］．

本文通過(guò)GA將Hb修飾到金電極上，利用循環(huán)伏安法研究了該修飾電極在磷酸鹽緩沖溶液中的電化學(xué)行為;并利用制備的Hb/GA膜修飾電極，研究了Hb與氨茶堿之間的相互作用，構(gòu)建了氨茶堿的電化學(xué)傳感器．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

CHI 832B型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，使用標(biāo)準(zhǔn)三電極體系：Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，金電極(或修飾金電極)為工作電極;pHS-3CT精密pH計(jì)(上海智光儀器儀表有限公司);SB-5200 DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)．

血紅蛋白(Hb，上海博蘊(yùn)生物科技有限公司);戊二醛(GA，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠(chǎng));氨茶堿(AMP，Sigma公司)．其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水．

1．2 修飾電極的制備

將金電極在涂有Al2O3懸濁液的麂皮上拋光至鏡面，依次用水和1∶1乙醇溶液超聲清洗20 s左右，然后置于1 mol/L H2SO4溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描直至穩(wěn)定．

把經(jīng)過(guò)預(yù)處理的金電極置于 5．0×10－5mol/L Hb溶液中，于1．5～2．0 V 電沉積90 min，使Hb充分吸附在電極表面，自然干燥后加1～2滴GA，室溫下使溶劑揮發(fā)形成修飾膜，即可得Hb/GA膜修飾金電極．

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

以Hb/GA膜修飾金電極或裸金電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，以 0．1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 6．00)為支持電解質(zhì)，在一定電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)實(shí)驗(yàn)，記錄相應(yīng)的CV曲線(xiàn)．每次使用后將電極用水沖洗干凈．所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行．

2 結(jié)果與討論

2．1 Hb在修飾電極上的電化學(xué)行為

分別將裸金電極(Au)、GA膜修飾金電極(GA/Au)和Hb/GA膜修飾金電極(Hb/GA/Au)置于PBS(pH 6．00)中進(jìn)行CV掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1．由圖1可知，裸金電極、GA膜修飾金電極沒(méi)有氧化還原峰(見(jiàn)圖1中b，c)，Hb/GA膜修飾金電極有一對(duì)很好的氧化還原峰(見(jiàn)圖1中a)，可逆性也明顯改善，說(shuō)明Hb能夠滲透進(jìn)入GA膜中與其發(fā)生某種作用而具備了發(fā)生直接電化學(xué)反應(yīng)的特定取向．在100 mV/s掃描速度下，其氧化峰電位Ep，a和還原峰電位 Ep，c分別為 0．341 V 和 0．297 V，峰電位差ΔE為44 mV，氧化還原峰電流之比Ip，a/Ip，c=1．17，說(shuō)明 Hb 在 GA 膜修飾電極上的氧化還原過(guò)程是可逆過(guò)程，GA膜對(duì)Hb的吸附固定和在電極上的直接電子轉(zhuǎn)移起到了重要的作用．

圖1 不同電極的循環(huán)伏安圖

2．2 底液及pH的選擇

用循環(huán)伏安法考察了不同的支持電解質(zhì)(Britton-Robinson(B-R)，HAc-NaAc，Tris-HCl和磷酸鹽緩沖溶液)對(duì)Hb在修飾電極上電化學(xué)行為的影響．從圖2可以看出，Hb在0．1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中的峰形好、峰電流高，有最好的電流響應(yīng)．Hb在修飾電極上的電化學(xué)行為隨磷酸鹽緩沖溶液pH值的變化情況見(jiàn)圖3．從圖3可以看出：當(dāng)溶液pH值為4．00～6．00時(shí)，氧化峰電流隨pH值的增大而增大，表明Hb的電子轉(zhuǎn)移強(qiáng)度逐漸增大;pH值為6．00～8．00時(shí)，氧化峰電流隨pH值的增大而下降，表明Hb電子轉(zhuǎn)移強(qiáng)度逐漸減?。@主要是因?yàn)镠b的活性依賴(lài)于溶液pH(正常人體生理pH為6．0～8．5)，過(guò)低或過(guò)高的pH都會(huì)降低Hb的活性．此外，隨pH值的變化，Hb的氧化峰電位變化不大．因此，考慮到Hb的生物特性，選用pH 6．00的0．1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液作為測(cè)試底液．

圖2 Hb在不同緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖

圖3 pH對(duì)Hb在修飾電極上電化學(xué)行為的影響

2．3 掃描速率的影響

考察了不同掃描速率(0．2～1．0 V/s)下Hb/GA/Au電極的循環(huán)伏安行為，結(jié)果見(jiàn)圖4．從圖4可以看出，Hb/GA/Au電極的CV圖具有近似對(duì)稱(chēng)的峰形和幾乎等高的陰極峰和陽(yáng)極峰，且隨著掃描速率的增大，陽(yáng)極峰電位正移，陰極峰電位負(fù)移．陽(yáng)極峰電流與掃描速率成正比(見(jiàn)圖5，其線(xiàn)性關(guān)系為：峰電流 Ip=85．609v+1．610 7，相關(guān)系數(shù)R=0．999 4)．說(shuō)明Hb的電極反應(yīng)是受表面控制的過(guò)程．

2．4 電沉積時(shí)間的影響

圖4 不同掃描速率下Hb/GA/Au電極的CV圖

圖5 Hb修飾電極峰電流與掃描速率間的關(guān)系

圖6 不同電沉積時(shí)間下Hb修飾電極的CV圖

本實(shí)驗(yàn)采用包埋法固定Hb分子到金電極表面得到Hb/GA/Au修飾電極，考察了電沉積時(shí)間分別為30，60，90 min時(shí)對(duì)修飾電極靈敏度的影響．由圖6可見(jiàn)：若電沉積時(shí)間過(guò)短，則沒(méi)有明顯的峰電流，隨著電沉積時(shí)間的增長(zhǎng)，峰電流逐漸增大;但當(dāng)電沉積時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(＞90 min)時(shí)，峰電流也隨之減小，且陽(yáng)極峰電位向正方向移動(dòng)．這可能是因?yàn)椋寒?dāng)電沉積時(shí)間過(guò)短時(shí)，Hb分子還未聚合到電極表面就進(jìn)行包埋;隨著電沉積時(shí)間的增長(zhǎng)，Hb固載量增加，峰電流逐漸增大;但當(dāng)電沉積時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，由于包埋Hb的環(huán)境發(fā)生改變，電極表面物質(zhì)的分布趨于復(fù)雜，Hb在電極表面過(guò)量吸附，降低了電子的傳遞能力，且造成了電極響應(yīng)電流下降的趨勢(shì)．因此，選擇電沉積時(shí)間為90 min．

2．5 修飾電極的穩(wěn)定性

將Hb/GA/Au修飾電極在相同條件下反復(fù)進(jìn)行CV掃描11次，測(cè)定陽(yáng)極電流的變化趨勢(shì)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)求出其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0．06%．將此修飾電極置于0．1 mol/L PBS(pH 6．00)中放入4℃冰箱保存，每天進(jìn)行CV掃描，3 d后電流下降了約10%，表明此電極有良好的穩(wěn)定性．

2．6 氨茶堿與Hb的相互作用

文獻(xiàn)［16-17］報(bào)道電活性小分子結(jié)合生物大分子后會(huì)形成一種非電活性的配合物，不能在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而降低了Hb的平衡濃度，使Hb的氧化還原電流降低．本實(shí)驗(yàn)用CV法研究氨茶堿與Hb之間相互作用的結(jié)果表明，隨著所加入氨茶堿濃度的增大，Hb的氧化還原電流呈下降趨勢(shì)，當(dāng)氨茶堿的濃度達(dá)到一定程度時(shí)，電流下降程度趨于平緩，說(shuō)明此時(shí)Hb與氨茶堿之間的結(jié)合基本達(dá)到飽和．因此，可以認(rèn)為氨茶堿與Hb形成了一種非電活性超分子化合物．

對(duì)于Hb與氨茶堿(AMP)形成的非電活性超分子化合物，可結(jié)合文獻(xiàn)［18-19］求算出兩者相互作用的結(jié)合數(shù)m．假設(shè)兩者生成簡(jiǎn)單的化合物Hb-mAMP，方程式

的平衡常數(shù)為

由此，可得到以下關(guān)系式：

從而，可以推出

圖7 lg(ΔI/ΔImax－ΔI)與 lg［AMP］的關(guān)系

式(6)中：ΔI為有無(wú)氨茶堿的峰電流之差;ΔImax是電流變化的最大值．如果Hb與AMP形成單一的化合物，則 lg(ΔI/ΔImax－ ΔI)與 lg［AMP］應(yīng)呈線(xiàn)性關(guān)系，斜率m即為結(jié)合數(shù)．以lg(ΔI/ΔImax－ΔI)為縱坐標(biāo)，lg［AMP］為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性擬合(見(jiàn)圖7)，可得到擬合方程：y=0．034 9x －0．124 1，相關(guān)系數(shù)R=0．987 9，計(jì)算得結(jié)合數(shù)m=2．

3 結(jié)論

以GA作為偶聯(lián)劑將Hb固定于金電極表面，制得了Hb/GA膜修飾金電極，GA膜的存在加快了Hb與金電極間的電子轉(zhuǎn)移．結(jié)果表明，Hb在GA膜修飾金電極上的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程是一個(gè)受吸附控制的氧化還原過(guò)程．利用此修飾電極，用CV法研究了Hb和平喘藥物氨茶堿之間的相互作用，求得Hb和氨茶堿的結(jié)合數(shù)為2．

［1］Lu Qing，Hu Chengguo，Cui Ran，et al．Direct electron transfer of hemoglobin founded on electron tunneling of CTAB monolayer［J］．J Phys Chem B，2007，111(33)：9808-9813．

［2］Yin Fan，Shin H K，Kwon Y S．Direct electrochemistry of hemoglobin immobilized on gold electrode by Langmuir-Blodgett technique［J］．Biosens Bioelectron，2005，21(1)：21-29．

［3］Xu Yanxia，Hu Chengguo，Hu Shengshui．Single-chain surfactant monolayer on carbon paste electrode and its application for the studies on the direct electron transfer of hemoglobin［J］．Bioelectrochemistry，2009，74(2)：254-259．

［4］后雯璟，周琳，吳霞琴，等．血紅蛋白在類(lèi)生物膜修飾電極上的直接電化學(xué)［J］．電化學(xué)，2008，14(3)：258-262．

［5］武五愛(ài)，郭滿(mǎn)棟，尹志芬，等．血紅蛋白在納米孔徑氧化鋁膜修飾電極上的直接電化學(xué)［J］．化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，67(8)：781-785．

［6］張敏，程發(fā)良，蔡志泉，等．血紅蛋白在納米金修飾電極上的電化學(xué)研究［J］．化學(xué)研究與應(yīng)用，2008，20(7)：872-875．

［7］羅曉虹，妮娜，劉凱，等．血紅蛋白在殼聚糖修飾碳納米管上的電化學(xué)特性及對(duì)過(guò)氧化氫的電催化分析［J］．分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2009，28(7)：809-813．

［8］李業(yè)梅，劉傳銀，劉慧宏．甲基纖維素膜固載血紅蛋白的直接電化學(xué)［J］．河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，29(3)：277-280．

［9］Han Xiaojun，Huang Weimin，Jia Jianbo，et al．Direct electrochemistry of hemoglobin in egg-phosphatidylcholine films and its catalysis to H2O2［J］．Biosensors ＆ Bioelectronics，2002，17(9)：741-746．

［10］Wang Jing，Liang Zhiqiang，Wang Lihua，et al．Electron transfer reactivity and catalytic activity of structurally rigidized hemoglobin［J］．Sensors and Actuators B：Chemical，2007，125(1)：17-21．

［11］Liu Guodong，Lin Yuehe，Ostatna V，et al．Enzyme nanoparticles-based electronic biosensor［J］．Chem Commun，2005(27)：3481-3483．

［12］李昌安，葛存旺，劉戰(zhàn)輝，等．戊二醛偶聯(lián)組氨酸修飾金電極測(cè)定銅離子的研究［J］．傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2003(4)：475-479．

［13］辛蓉．藥物學(xué)基礎(chǔ)［M］．北京：高等教育出版社，2005：122-123．

［14］Parikh H H，McElwain K，Balasubramanian V，et al．A rapid spectrofluorimetric technique for determining drug-serum protein binding suitable for high-throughput screening［J］．Pharmaceutical Research，2000，17(5)：632-637．

［15］De Smet R，Vogeleere P，Van Kaer J，et al．Study by means of high-performance liquid chromatography of solutes that decrease theophylline/protein binding in the serum of uremic patients［J］．J Chromatogr A，1999，847(1/2)：141-153．

［16］Zhu Zhiwei，Li Nanqiang．Electrochemical studies of 9，10-anthraquinone interacting with hemoglobin and determination of hemoglobin［J］．Microchim Acta，1999，130(4)：301-308．

［17］Feng Qu，Li Nanqiang，Jiang Yuyang．Electrochemical studies of porphyrin interacting with DNA and determination of DNA［J］．Anal Chim Acta，1997，344(1/2)：97-104．

［18］Zhu Zhiwei，Li Nanqiang．Electrochemical studies of the interaction of 9，10-anthraquinone with DNA［J］．Microchem J，1998，59(2)：294-306．

［19］Matthew J B，Hanania G I，Gurd F R．Electrostatic effects in hemoglobin：hydrogen ion equilibria in human deoxy-and oxyhemoglobin A［J］．Biochem，1979，18(10)：1919-1928．