李 忠 侯吉光 蘇清秀 劉博宇 楊艷明 (吉林省腫瘤醫(yī)院放療科研究室，吉林 長春 300)

腦膠質(zhì)瘤可導(dǎo)致患者出現(xiàn)致殘和腦功能缺失表現(xiàn)，死亡率很高。而目前臨床上對(duì)腦膠質(zhì)瘤有效的化療藥物又很少，主要以放射治療和手術(shù)治療為主〔1〕。紫杉醇(Paclitaxel)可使細(xì)胞增殖周期阻滯于G2/M期，表達(dá)廣泛的抗腫瘤活性，還可增強(qiáng)某些腫瘤的輻射效應(yīng)〔2，3〕，但紫杉醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的輻射增敏作用尚有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)觀察了紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制和輻射增敏作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品和細(xì)胞培養(yǎng) 紫杉醇由中科院長春應(yīng)用化學(xué)研究所惠贈(zèng)，以RPMI 1640培養(yǎng)液溶解。人膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞系購自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部生化與分子生物學(xué)教研室，用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco)，培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，2～3 d傳一代。

1.2 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期生長的SHG-44細(xì)胞，0.25%胰酶消化，接種于96孔板，每孔100 μl(約2×104個(gè)細(xì)胞)，每孔分別加入不同濃度(0、0.062 5、1.25、2.5、5 和10 μg/ml)的紫杉醇溶液100 μl，每一濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔。分別在加藥1、3 和7 d 后，每孔加入MTT 10 μl(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入 DMSO(Sigma，美國)100 μl，室溫下?lián)u床振蕩30 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm波長處測(cè)定其吸光度(A值)，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 輻射增敏實(shí)驗(yàn)

1.3.1 照射條件 國產(chǎn)X射線治療機(jī)照射，電壓120 kV，電流15 mA，濾板 2 mm Al。球靶距 30 cm，吸收劑量率為0.62 Gy/min。

1.3.2 細(xì)胞處理 取對(duì)數(shù)期生長的SHG-44細(xì)胞，0.25%胰酶消化，接種直徑60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每皿1 ml細(xì)胞(約1×103個(gè))，加入不同濃度(0、0.062 5、1.25、2.5、5 和 10 μg/ml)紫杉醇作用24 h，分別進(jìn)行3 Gy與6 Gy X射線照射，繼續(xù)在CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)14 d，觀察對(duì)照組出現(xiàn)肉眼可見的克隆后，用75%乙醇固定，Giemsa染色，計(jì)克隆數(shù)(含50個(gè)細(xì)胞以上)，并計(jì)算存活分?jǐn)?shù)(SF)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。SF=照射后細(xì)胞形成的集落數(shù)/(接種細(xì)胞數(shù)×未照射細(xì)胞集落形成數(shù))。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紫杉醇與輻射作用后細(xì)胞凋亡的變化取指數(shù)生長的SHG-44細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×105，無血清RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞同步化后，用含10%新生牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，不同濃度(0、0.625、1.25、2.5 和 5.0 μg/ml)紫杉醇作用24 h后，進(jìn)行不同劑量(吸收劑量為3 Gy、6 Gy)X射線照射，24 h后終止培養(yǎng)，1 000 r/min離心后70%冰乙醇固定，-20℃保存。將制備好的單細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心10 min，棄去固定液，冷PBS漂洗2次，調(diào)整細(xì)胞為1×109個(gè)/L，加入PI染液1.0 ml，避光染色30 min，流式細(xì)胞儀(Beckman，美國)檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率，數(shù)據(jù)用CellQuest軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇對(duì)SHG-44細(xì)胞的生長抑制作用 MTT結(jié)果顯示，不同濃度的紫杉醇對(duì)SHG-44細(xì)胞的生長具有抑制作用，隨濃度增加，抑制效果明顯增強(qiáng)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，紫杉醇的生長抑制作用隨著作用時(shí)間的延長明顯增加，1、3和7 d的抑制率之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

2.2 紫杉醇的輻射增敏作用 不同濃度紫杉醇及3 Gy和6 Gy X射線照射后，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后，各組形成的克隆數(shù)明顯不同。不同濃度的紫杉醇作用24 h后，進(jìn)行3 Gy和6 Gy X射線照射，不同輻射劑量組合的各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);相同的輻射劑量、不同濃度的紫杉醇作用組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見圖1。

2.3 紫杉醇作用后細(xì)胞凋亡的變化 應(yīng)用紫杉醇能夠明顯提高放射對(duì)SHG-44細(xì)胞的殺傷作用，細(xì)胞凋亡率明顯高于單獨(dú)放射組，且隨著紫杉醇濃度的增加而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

表1 不同濃度、作用時(shí)間的紫杉醇對(duì)SHG-44細(xì)胞的抑制率(n=6，s)

表1 不同濃度、作用時(shí)間的紫杉醇對(duì)SHG-44細(xì)胞的抑制率(n=6，s)

與作用時(shí)間1 d比較：1)P＜0.01

紫杉醇藥物濃度(μg/ml)1 d 3 d 7 d 0.625 12.88±1.33 27.22±3.591) 39.44±3.711)1.25 23.01±2.45 46.13±3.321) 51.89±3.101)2.5 32.56±2.79 54.11±2.151) 67.7±3.711)5.0 46.12±4.16 61.70±3.161) 70.40±3.271)10.0 59.45±3.01 69.85±3.061) 74.85±3.151)

圖1 SHG-44細(xì)胞在不同濃度紫杉醇與X射線照射聯(lián)合作用后克隆形成率變化

圖2 SHG-44細(xì)胞在不同紫杉醇與X射線照射聯(lián)合作用后24 h的細(xì)胞凋亡百分率

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最為常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的44%〔4〕。膠質(zhì)瘤多浸潤性生長，手術(shù)很難將顱內(nèi)侵襲灶完全切除，目前多采用手術(shù)、化學(xué)治療或放射治療聯(lián)合治療。因此最大限度殺傷腫瘤細(xì)胞成為膠質(zhì)瘤綜合治療中的重要環(huán)節(jié)〔5，6〕。目前化療與放療并用起到協(xié)同的結(jié)果，以期改善惡性腫瘤的治療效果，并減少兩者的毒副作用。不少學(xué)者期望通過輻射增敏作用這一設(shè)想，尋找某些具有輻射增敏的化療藥物與放療相結(jié)合，這樣在減少放化療劑量、減輕各自副作用的同時(shí)達(dá)到同樣甚至更好的治療效果〔7〕。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)應(yīng)用低劑量的紫杉醇治療腫瘤既具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性又有放射增敏特性，為下一步研究提供了良好的依據(jù)。紫杉醇聯(lián)合X射線照射作用于SHG-44細(xì)胞，在降低細(xì)胞集落形成率方面具有協(xié)同作用，提示紫杉醇在體外對(duì)SHG-44細(xì)胞具有輻射增敏作用，并且這種放射增敏作用具有劑量依賴性。

目前放射生物學(xué)研究表明細(xì)胞凋亡是放射治療的核心問題，凋亡調(diào)控機(jī)制在細(xì)胞放射敏感性方面起著重要作用。細(xì)胞放射敏感性在一定程度上取決于促進(jìn)凋亡因素和抑制凋亡因素之間的相互作用，如果通過化學(xué)藥物促進(jìn)凋亡的因素上調(diào)，那么細(xì)胞受到電離輻射后就很容易啟動(dòng)凋亡通路，則放射敏感性就會(huì)增強(qiáng)。多數(shù)研究結(jié)果證明，凋亡反應(yīng)的增加同時(shí)伴有細(xì)胞放射敏感性增高，凋亡的細(xì)胞具有更高放射敏感性〔8，9〕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)紫杉醇在0.625～10 μg/ml范圍內(nèi)作用后能增加SHG-44細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，且有濃度依賴性，凋亡率增加。由此推斷其可以促進(jìn)放射損傷效應(yīng)。而且有些研究證實(shí)它能使細(xì)胞周期阻滯在放射敏感的G2/M期，或通過改變細(xì)胞周期檢查點(diǎn)來增加放射誘導(dǎo)的凋亡，從而增加放射敏感性。因此，通過紫杉醇提高放射線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率，可增強(qiáng)放射線的抗瘤作用〔10〕。

1 Drago-Ferrante R，Santulli A，Di Fiore R，et al.Low doses of paclitaxel potently induce apoptosis in human retinoblastoma Y79 cells by upregulating EF1〔J〕.Int J Oncol，2008;33(4)：677-87.

2 Kim ES，Khun FR.Docetaxel and radiation as combined modality therapy〔J〕.Oncology，2002;16(suppl)：97：105-10.

3 Mason KA，Milas L，Peters LJ.Effect of paclitaxel(taxol)alone and in combination with radiati on on the gastrointestinal mucosa〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1995;32(5)：1381-9.

4 王忠誠.神經(jīng)外科學(xué)〔M〕.武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2005：512.

5 Kemper EM，Boogerd W，Thuis I，et al.Modulation of the blood-brain barrier in oncology：therapeutic opportunities for the treatment of brain tumours〔J〕.Cancer Treat Rev，2004;30：415-23.

6 Zeng SY，Li LY，Shu KY，et al.Chemoradiotherapy versus radiotherapy in advanced cervical carcinoma〔J〕.Ai Zheng，2008;27(9)：942-6.

7 Schuck A，Muller SB，Kohler A，et al.Combined radiochemotherapy with paclitaxel in the treatment of malignant glioma〔J〕.Strahlenther Onkol，2002;178(9)：486-90.

8 Mason KA，Hunter NR，Milas M，et al.Docetaxel enhances tumor radio response in vivo〔J〕.Clin Cancer Res，1997;3(12Pt1)：2431-8.

9 Supiot S，Gouard S，Charrier J，et al.Mechanisms of cell sensitization to alpha radioimmunotherapy by doxorubicin or paclitaxel in multiple myeloma cell lines〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(19Pt 2)：7047-52.

10 Gupta N，Hu LJ，Deen DF.Cytotoxicity and cell-cycle effects of paclitaxel when used as a single agent and in combination with ionizing radiation〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，1997;37：885-95.