李 程 畢旭東 趙國偉 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121001)

肝臟是易受缺血再灌注損傷的器官，其缺血再灌注損傷〔1〕是肝臟外科常見的問題。通過傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)手段防治缺血再灌注，保護(hù)肝功能是臨床醫(yī)師的一條可選之路。大量研究證實(shí)，活血化瘀中藥，對肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)具有保護(hù)作用〔2，3〕，而丹參正是此類藥物，其有關(guān)作用機(jī)制的研究很多，其中PI3KAkt信號傳導(dǎo)通路〔4，5〕受到較多關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)選擇研究丹參注射液對大鼠肝缺血再灌注后PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路的影響，以期明確其對HIRI的保護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠80只，體重250～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物及試劑 丹參注射液(四川三精升和制藥有限公司，批號：Z51021303);PI3K、Akt抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);Phospho-Akt(Thr308)抗體、PI3K抑制劑(LY294002)(碧云天生物技術(shù)研究所);細(xì)胞凋亡試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制作 隨機(jī)分為四組，即假手術(shù)組、IR組、SI組和 LY組，各組再按再灌注時(shí)間1、3、6、24 h分為4個(gè)時(shí)相，每組每時(shí)相為5只。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水，術(shù)前10%水合氯醛3.0 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。IR組：仰臥位，腹部正中切口，按Yoshidome法，分離出肝十二指腸韌帶，用無損傷動(dòng)脈夾鉗閉肝中葉和左側(cè)葉的動(dòng)脈、門靜脈和膽管，造成70%肝缺血模型，切口覆蓋溫濕紗布，60 min后松開動(dòng)脈夾恢復(fù)血供，每只大鼠分別于缺血前30 min經(jīng)尾靜脈緩慢注射生理鹽水2.0 ml;假手術(shù)組：單純麻醉和開腹，分離出肝十二指腸韌帶，僅暴露肝中葉和左側(cè)葉動(dòng)脈、門靜脈和膽管，不進(jìn)行阻斷，余同IR組;SI組：按2 ml/kg，用生理鹽水稀釋至2.0 ml，于阻斷血供前30 min經(jīng)尾靜脈注入，余同 IR組;LY組：按 LY 1.5 mg/kg，丹參2 ml/kg，分別用生理鹽水稀釋，要求兩者稀釋后總量為2 ml，且LY和SI分別于阻斷前1 h和30 min經(jīng)尾靜脈注入，余同IR組。

1.3.2 標(biāo)本收集 各組分別在再灌注1、3、6、24 h對五只大鼠采取心腔針刺采血約5 ml，室溫靜置約1 h后于3 000 r/min離心10 min，取血清待測;取左肝葉組織，置于4℃生理鹽水中充分洗去血液后以濾紙拭干，置于液氮中，于-80℃冰箱保存待測;再取左葉肝組織，置于10%甲醛溶液中固定。

1.3.3 ALT、AST、LDH的測定 用全自動(dòng)化生化分析儀檢測。

1.3.4 病理切片制作及HIRI病理診斷標(biāo)準(zhǔn) 取10%甲醛溶液中固定48 h后的肝組織，逐級乙醇脫水，二甲苯浸泡，浸蠟、石蠟包埋、切片、附貼，HE染色。HIRI病理損傷的嚴(yán)重程度用Suzuki標(biāo)準(zhǔn)〔4，5〕評定，由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)生采用雙盲法對每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行評分。

1.3.5 TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡 操作TUNEL試劑盒按說明書進(jìn)行。用不含末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)作陰性對照，用DNA酶Ⅰ處理的組織切片作陽性對照。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核呈棕黃色著色者為凋亡細(xì)胞。每例切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)400倍視野，平均每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)為細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。

1.3.6 PI3K、Akt、p-Akt酶的測定 取已準(zhǔn)備存放于-80℃的肝組織，稱取0.1 g，冰浴，加入500 μl組織裂解液，冰浴勻漿，4℃，12 000 r/min離心10 min收集上清，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。其余樣品用4×loading buffer稀釋，封閉后100℃水浴10 min，-80℃保存。以每個(gè)樣品的總蛋白為20 g上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF，脫脂奶粉封閉，一抗封閉4℃過夜，二抗37℃孵育1 h(羊抗兔)，漂洗后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)，自動(dòng)掃描，應(yīng)用進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以s表示。組間差異應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血清ALT、AST、LDH水平 IR、SI、LY組肝缺血再灌注后各時(shí)相的ALT、AST、LDH值明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05);SI組、LY組各個(gè)時(shí)相的值較IR組均下降(P＜0.05);與LY組比較，SI組各個(gè)時(shí)相的值均明顯下降(P＜0.05);其中，ALT、AST、LDH值在缺血再灌注后均升高，IR、SI和LY組組內(nèi)各時(shí)相各值均在再灌注后6 h最高(P＜0.05)。見表1～表3。

表1 各組血清AST濃度變化(s，U/L，n=5)

表1 各組血清AST濃度變化(s，U/L，n=5)

與I/R組比較：1)P＜0.05;與SI組比較：2)P＜0.05，下表同

1 h 3 h 6 h 24 h組別

2.2 肝細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化 取6 h肝組織切片，HE染色，光鏡下觀察。假手術(shù)組肝細(xì)胞及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞正常，肝竇及肝索排列規(guī)則;IR組肝組織中大量炎性細(xì)胞聚集、浸潤，以中央靜脈為甚，肝竇變窄，肝索排列紊亂，可見肝細(xì)胞水腫及空泡樣變性，偶見點(diǎn)狀壞死;LY組較IR組肝淤血程度輕，肝索及肝竇排列較規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤較輕;SI組的肝小葉及肝血竇淤血程度輕，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞變性不明顯，少有炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組肝細(xì)胞病理HE染色結(jié)果(×400)

表2 各組血清ALT濃度變化(s，U/L，n=20)

表2 各組血清ALT濃度變化(s，U/L，n=20)

1 h 3 h 6 h 24 h假手術(shù)組 68.10±5.90 68.73±4.73 65.33±3.95 63.81±4.33組別IR 203.08±12.13 599.62±15.24 869.16±26.12 233.19±7.38 SI 142.97±9.671) 312.22±9.701) 514.33±16.501)130.92±6.811)LY 171.84±3.612)398.34±11.322) 714.02±20.272)159.88±7.042)

表3 各組LDH濃度變化( s，U/L，n=20)

表3 各組LDH濃度變化( s，U/L，n=20)

1 h 3 h 6 h 24 h假手術(shù)組 424.50±16.79 435.36±13.04 456.82±19.69 454組別.20±24.64 IR 1143.65±66.48 3 179.10±124.21 4 785.39±150.26 853.76±29.21 SI 889.35±54.991) 1 331.85±28.481)1 800.34±105.091)581.54±23.721)LY 1 003.43±52.592)2 004.89±111.472)1 799.76±86.172) 582.32±21.562)

圖2 各組凋亡檢測結(jié)果(×400)

2.3 各組AI比較 圖2所示，與假手術(shù)組比較，IR、SI、LY組各時(shí)相肝細(xì)胞AI值均增加(0.91±0.19，36.05±4.22，14.5±1.74，24.71±3.21，P ＜0.05);與 IR 組比較，SI組及 LY 組各時(shí)相AI值均減少(P＜0.05);與LY組比較，SI組各時(shí)相AI值均減少(P＜0.05);其中IR、SI、LY組組內(nèi)各時(shí)相以再灌注6 h時(shí)AI值最高。

2.4 檢測PI3K、Akt、p-Akt 各組PI3K、AKT的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05);而在p-Akt的表達(dá)中，假手術(shù)、IR、LY組組間無顯著差異(P＞0.05)，SI組的表達(dá)各時(shí)相都高于假手術(shù)、IR、LY組，且均有顯著差異(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組p-AKT表達(dá)

3 討論

肝切除過程中常需要阻斷肝門而不可避免地產(chǎn)生肝臟缺血再灌注損傷，而該損傷機(jī)制是影響剩余肝臟功能的關(guān)鍵因素之一〔6〕。丹參在防治和減輕肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用〔7，8〕，本實(shí)驗(yàn)就其是否通過影響 PI3K-AKT信號傳導(dǎo)通路的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用方面作初步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL法和Western印跡法可以觀察到，丹參注射液預(yù)處理組凋亡細(xì)胞數(shù)以及凋亡指數(shù)明顯下降，同時(shí)伴隨有AKT的磷酸化水平的顯著增加，而PI3K-AKT信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與細(xì)胞生命活動(dòng)密切相關(guān)，Akt的磷酸化正是PI3K-AKT信號通路活化，發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵〔9〕。凋亡是導(dǎo)致再灌注損傷，肝臟細(xì)胞丟失的重要病理形式之一。通過干預(yù)減少再灌注肝臟細(xì)胞的凋亡有助于減輕再灌注后肝臟的損傷，促進(jìn)肝臟功能恢復(fù)和保持。PI3K-AKT通路的活化后，磷酸化的Akt表達(dá)水平增加，向細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，使底物蛋白特定部位的絲/蘇氨酸發(fā)生磷酸化，介導(dǎo)抗凋亡蛋白或蛋白激酶的調(diào)節(jié)，直接影響肝臟細(xì)胞的抗凋亡機(jī)制的活化，減少細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，與同時(shí)相SI組大鼠比較，LY組大鼠在加用阻斷劑LY294002后，肝細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)明顯降低、肝功酶升高、肝細(xì)胞損害加重。由此可以推測，PI3K/AKT信號通路的激活可有效地抑制肝細(xì)胞凋亡發(fā)生，在大鼠肝IR損傷種起到一定的保護(hù)作用。其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制為，丹參注射液使該通路活化，激活p-Akt，它處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，是PI3K下游的直接靶點(diǎn)，傳遞由PI3K始動(dòng)的信息。p-Akt可直接磷酸化前凋亡基因BAD和bax，激活抗凋亡蛋白bcl-2，防止線粒體釋放凋亡因子來促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞凋亡。此外，一些具有肝保護(hù)作用的因子，如胰島素〔10〕、NO〔11〕、促紅細(xì)胞生成素〔12〕均可通過激活PI3K/AKT通路抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。PI3K/AKT信號通路參與細(xì)胞營養(yǎng)代謝、存活、生長、炎癥反應(yīng)和凋亡等重要生物學(xué)事件，可以降低缺血-再灌注損傷的發(fā)病率及死亡率。

本實(shí)驗(yàn)中在應(yīng)用特異性PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002時(shí)，抑制了AKT磷酸化水平的表達(dá)，從而阻斷丹參注射液對肝臟缺血再灌注的保護(hù)作用。由此可見，丹參注射液抑制肝臟細(xì)胞的凋亡，其作用是通過激活PI3K/AKT信號通路來減少缺血再灌注損傷。

綜上所述，丹參注射液預(yù)處理對肝臟缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡具有抑制效應(yīng)，而這種保護(hù)效應(yīng)能被LY294002阻斷，故丹參注射液預(yù)處理抑制缺血再灌注肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)效應(yīng)可能與激活PI3K-AKT信號途徑有關(guān)，并且p-Akt處于這一通路的中心環(huán)節(jié)，發(fā)揮重要作用。

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