郭紅艷 孫曉杰 劉秀財(cái) 樊 麗 于英君

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

近幾年的研究表明，血清糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(SGK3)可能是多種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一個(gè)功能性交匯點(diǎn)，可被應(yīng)激因素誘導(dǎo)激活，在調(diào)節(jié)離子通道、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用〔1〕。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳類SGK的異構(gòu)酶有SGK1、SGK2和SGK3(也稱CISK)三種，迄今為止，研究較多的是SGK1，其對(duì)鼠的毛囊形態(tài)發(fā)生、自身穩(wěn)定以及腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收等具有重要作用〔2，3〕。而關(guān)于SGK3的研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，國(guó)外的報(bào)道也較少，有文獻(xiàn)報(bào)道SGK3可能參與了細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和Wnt信號(hào)通路〔4〕，但其在人類細(xì)胞中的生物學(xué)功能至今尚未闡明。最新研究顯示，CISK/SGK3對(duì)白細(xì)胞介素-3(IL-3)撤退所誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用〔5〕。在此基礎(chǔ)上，本文將研究CISK/SGK3與乳腺癌細(xì)胞凋亡發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性及其相關(guān)機(jī)制，初步闡明CISK/SGK3的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒 乳腺癌細(xì)胞MCF7由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供，細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。本研究所用pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒由美國(guó)霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院夏獻(xiàn)民博士惠贈(zèng)，pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒含有人SGK3 cDNA基因，全長(zhǎng)為1.3 kb，含BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)。

1.1.2 主要試劑和抗體 RPMI1640、G418購(gòu)自Gibco BRL公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板購(gòu)自英國(guó)Nunc公司;BamH I和Xho I購(gòu)自寶生物工程有限公司;biozol、RT-PCR試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司;凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自嘉美生物科技有限公司;SGK3多克隆抗體購(gòu)自 CST公司;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購(gòu)自康為世紀(jì)科技有限公司;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pEGFP-N1-SGK3重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)SGK3的全長(zhǎng)cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并分別在上游引物和下游引物前加上限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamH I識(shí)別序列及接頭，通過(guò)PCR方法從pAcG-4T3-SKG3質(zhì)粒中擴(kuò)增SGK3基因。上游引物序列為5'CCGCTCGAGACCATGGCCCTGAAGATTC 3'，下游引物序列為5'CGC GGA TCC AAA AAT AAG TCT TCT G 3'。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后與同樣酶切的載體pEGFP-N1連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3。陽(yáng)性菌株送至上海Invitrogen公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genbank源基因用網(wǎng)絡(luò)軟件ClustalW進(jìn)行基因比對(duì)，同時(shí)提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.2 基因轉(zhuǎn)染 采用GenEscortTMⅠ 進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，生長(zhǎng)良好的乳腺癌細(xì)胞株(MCF7)于轉(zhuǎn)染前24 h接種到6孔板中，待細(xì)胞總面積達(dá)到60% ～80%，取3 μg pEGFP-N1-SGK3質(zhì)粒和空載體pEGFP-N1質(zhì)粒分別進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染(具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行)，用G418篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法鑒定。

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用四甲基唑藍(lán)(MTT)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后計(jì)數(shù)，按每孔5×102細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)4個(gè)平行孔，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每天取出一塊培養(yǎng)板，加5 g/L的MTT 20 μl于各孔中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，各孔加150 μl二甲基亞砜(DMSO)，于微量振蕩器振蕩15 min后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm的吸光度值，取4個(gè)孔的平均值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A570值為縱坐標(biāo)作圖，觀察細(xì)胞的增殖情況。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，常規(guī)消化處理各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，按細(xì)胞凋亡雙染色試驗(yàn)(Annexin V-FITC/PI)試劑盒說(shuō)明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，資料經(jīng)ModFitL T軟件分析。

1.2.5 凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用Biozol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，用RT-PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RI-PCR)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)bad、bcl-xl及內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(βactin)引物，引物由生工生物工程(上海)有限責(zé)任公司合成，引物序列及擴(kuò)增片段大小如下：β-actin：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'，5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng) 263 bp;bad：5'-CCATCCCTTCGTCGTCCTC-3';5'-GCTCCGGCAAGCATCATC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 162 bp;bcl-xl：5'-CGGGCATTCAGTGACCTGAC-3'， 5'-TCAGGAACCAGCGGTTGAAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度151 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，退火30 s(bad和 bcl-xl的退火溫度分別為51℃、52.3℃)，72℃ 延伸 60 s，循環(huán) 30 次，最后 72℃ 延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，AlphaImager圖像分析系統(tǒng)拍照、結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3的鑒定 重組質(zhì)粒pEGFPN1-SGK3經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明所獲SGK3酶切片段的大小與預(yù)期相符，經(jīng)DNA測(cè)序結(jié)果表明，所獲克隆序列與理論序列一致。見(jiàn)圖1。

圖1 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3酶切電泳圖

2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中SGK3蛋白表達(dá)的鑒定 重組質(zhì)粒pEGFPN1-SGK3和空載體質(zhì)粒pEGFP-N1分別轉(zhuǎn)染MCF7后，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。用抗SGK3抗體通過(guò)Western印跡方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SGK3在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中能夠有效地表達(dá)，而親本細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞中未檢測(cè)到內(nèi)源性SGK3的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 Western印跡檢測(cè)SGK3蛋白在MCF7轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 SGK3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng) 為了研究SGK3的過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)MTT法繪制了各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，與親本細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染SGK3的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯增快。見(jiàn)圖3。

2.4 SGK3抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡 各組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，在雙變量的FCM散點(diǎn)圖上，MCF-7親本細(xì)胞凋亡率為：第二象限(0.1%)+第四象限(8.9%)=9.0%，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pEGFP-N1細(xì)胞組凋亡率為：第二象限(1.4%)+第四象限(8.6%)=10.0%;轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3細(xì)胞組凋亡率為：第二象限(1.2%)+第四象限(4.4%)=5.6%?？梢?jiàn)，SGK3過(guò)表達(dá)可明顯抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖4。

圖3 外源性SGK3的過(guò)表達(dá)對(duì)MCF7細(xì)胞增殖的影響

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF7細(xì)胞凋亡的散點(diǎn)圖

2.5 RT-PCR結(jié)果 與MCF7親本細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒pEGFP-N1細(xì)胞的bad和bcl-xl表達(dá)無(wú)明顯變化;與以上兩組比較，SGK3過(guò)表達(dá)可致 MCF7細(xì)胞 bad mRNA表達(dá)降低和bcl-xl mRNA表達(dá)升高。見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞bcl-xl、bad mRNA表達(dá)

3 討論

SGK是1993年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與蛋白激酶B(PKB)第二信使蛋白具有極高同源性的Ser/Thr蛋白激酶，該基因全長(zhǎng)2.4 kb，序列高度保守，在各種哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞系中均有表達(dá)〔6〕。SGK是一個(gè)由多個(gè)成員組成的基因家族，其中與SGK(即SGK1)同源程度最高的是SGK2和SGK3，他們的催化結(jié)構(gòu)域具有高達(dá)80%的氨基酸序列相同，但很多方面具有顯著的不同之處〔7～9〕。在對(duì)SGK3功能的研究中發(fā)現(xiàn)，SGK3定位于細(xì)胞的內(nèi)體(endosome)，作為PI3K的下游分子，SGK3也能磷酸化Akt的一些底物如 Forkhead 家族成員轉(zhuǎn)錄因子(FKHRL1)〔10，11〕;另外，研究發(fā)現(xiàn)SGK3與情景記憶和恐怖記憶關(guān)系更密切，主要通過(guò)促進(jìn)谷氨酸受體1(GLUR1)的表達(dá)增強(qiáng)記憶〔12〕。雖然已有證據(jù)顯示，SGK3在某些腫瘤的形成過(guò)程中可能擔(dān)任著重要的角色，也有報(bào)道指出，SGK3對(duì)由于IL-3撤退所誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞MCF7凋亡具有保護(hù)作用;但迄今為止，有關(guān)SGK3在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制卻未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中，為了研究外源SGK3基因生物學(xué)功能，首先構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-N1-SGK3，進(jìn)而將該質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞，通過(guò)Western印跡方法對(duì)轉(zhuǎn)染基因的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了鑒定，且未檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)源性SGK3蛋白的表達(dá)。在隨后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SGK3基因的細(xì)胞其生長(zhǎng)速度明顯加快。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果顯示外源SGK3基因的過(guò)表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞bcl-xl mRNA表達(dá)上調(diào)，bad mRNA表達(dá)下調(diào)，提示外源SGK3基因可通過(guò)影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡。

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