陸永光 符春暉 嚴(yán) 華 黃軍章 (欽州市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣西 欽州 535000)

血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整性破壞和功能障礙是心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的早期的重要事件。近年來研究證實，內(nèi)皮細(xì)胞在各種刺激因素作用下激活和凋亡的過程中，可釋放出內(nèi)皮細(xì)胞微粒(EMPs)。EMPs不但可作為評價心血管疾病狀態(tài)下內(nèi)皮功能的指標(biāo)，而且還具有生物學(xué)活性，可以作為生物信使分子參與介導(dǎo)血管炎癥、血栓形成、血管生成等生物學(xué)過程〔1〕。阿托伐他汀具有獨立于降脂之外的抑制內(nèi)皮炎癥、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，延緩動脈粥樣硬化進(jìn)展的作用〔2〕。但阿托伐他汀對EMPs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制尚不清楚。研究表明，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號通路的激活與內(nèi)皮炎癥反應(yīng)存在著密切的關(guān)系〔3〕。本研究主要探討阿托伐他汀對EMPs誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響及與ERKl/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV-304(美國ATCC公司)。RPMI-1640培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青公司);TNF-α(英國PeProtech公司);異氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD42單克隆抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD31單克隆抗體(美國Proteintech Group公司);0.8 μm、3.0 μm 標(biāo)準(zhǔn)微粒(美國 Duke公司);阿托伐他汀(美國輝瑞公司);Trizol(美國Invitrogene公司);ERK1/2抑制劑PD98059(德國Calbiochem公司);PCR引物(上海生物工程有限公司);First-Strand cDNA Synthesis試劑盒、All-in-OneTM qPCR Mix(美國GeneCopoeia公司);鼠抗人ICAM-1抗體、鼠抗人β-actin抗體(美國Biolegend公司);鼠抗人磷酸化ERK1/2抗體、鼠抗人總ERK1/2抗體(美國Cell Signaling公司);辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG(北京中山生物技術(shù)公司);增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(美國Pierce公司)。

1.2 主要儀器 SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司);水套式二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司);Epics XL型流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司);CKX-41型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);FLX-800熒光酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);T personal PCR儀(德國 Biometra公司);ABI Prism 7500型熒光定量基因擴(kuò)增儀(美國ABI公司);Gel-Doc2000型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);垂直電泳儀、電泳槽、蛋白電泳轉(zhuǎn)膜裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HUVECs的培養(yǎng)和分組 將HUVECs細(xì)胞株ECV-304解凍復(fù)蘇后，加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，進(jìn)行傳代。將4～5代生長良好的細(xì)胞，用含10%血清1640培養(yǎng)基調(diào)成1×105/ml，接種于24孔板中，待細(xì)胞接近80%融合時換不含血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步后進(jìn)行干預(yù)。按實驗設(shè)計分為EMPs不同劑量干預(yù)組，用不同濃度(0、102、103、104、105/ml)EMPs 作用HUVECs 24 h;阿托伐他汀作用組，在加入EMPs前用不同濃度的阿托伐他汀(0、0.1、1、10 μmol/L)和終濃度為10 μmol/L的PD98059作用于HUVECs 1 h。每組6個復(fù)孔。

1.3.2 EMPs的制備 參照既往研究的方法用TNF-α刺激HUVECs制備 EMPs〔4〕。在 37℃ 下，用終濃度為 100 ng/ml的TNF-α與HUVECs孵育48 h，刺激 HUVECs產(chǎn)生 EMPs。將培養(yǎng)基上清離心5 min，去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片，然后再在10℃下離心2 h。用 PBS洗滌沉淀2次，以去除 TNF-α，用 PBS重懸EMPs。取100 μl分成兩管，一管加入 FITC-CD42單抗和 PECD31單抗各10 μl，另一管加入等量對照抗體，在室溫下孵育15 min，洗滌2次后，加入100 μl PBS液后即上流式細(xì)胞儀檢測。用0.8 μm標(biāo)準(zhǔn)微粒設(shè)門，3 μm標(biāo)準(zhǔn)微粒對EMPs進(jìn)行定量。樣本在上流式細(xì)胞儀檢測前分別加入105個0.8 μm和3 μm標(biāo)準(zhǔn)微粒，測定直徑0.8～3 μm的細(xì)胞膜微粒，當(dāng)收集到2×104個3 μm標(biāo)準(zhǔn)微粒后即停止計數(shù)，并作為參照標(biāo)準(zhǔn)計算出EMPs的濃度。EMPs定義為直徑小于1.0 μm且 CD31+/CD42-陽性的微粒。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測ICAM-1 mRNA的表達(dá) 收集細(xì)胞后，用Trizol一步法提取RNA。按試劑盒的說明配制25 μl反應(yīng)體系，在37℃反應(yīng)60 min，85℃滅活處理5 min，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA。引物序列設(shè)計如下：ICAM-1上游引物：5'-CCGGAAGGTGTATGAACTG-3'， 下 游 引 物：5'-TCCATGGTGATCTCTCCTC-3';β-actin 上游引物：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)，包括95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸31 s。反應(yīng)結(jié)束后記錄擴(kuò)增曲線和熔解曲線。根據(jù)2-ΔΔCt法分析ICAM-1的相對表達(dá)量，ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.3.4 蛋白免疫印跡檢測ICAM-1蛋白表達(dá)及ERK1/2磷酸化水平 收集各組HUVECs細(xì)胞，加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，用Bradford法測定蛋白的濃度。各組分別取蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。分離后的蛋白用電印法電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，分別加入 ICAM-1(1∶300)、p-ERK(1∶300)和 β-actin(1∶300)一抗，4℃過夜。漂洗后加對應(yīng)辣根過氧化物酶的二抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，采用Quantity One軟件進(jìn)行圖像灰度分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以s表示，多組間比較方差不齊，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩兩比較采用Nemenyi檢驗。

2 結(jié)果

2.1 EMPs對ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2表達(dá)的影響 從103個/ml開始，隨著EMPs濃度的增加，ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2的表達(dá)逐漸增加(均P＜0.01)。見表1和圖1。

2.2 阿托伐他汀對ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2表達(dá)的影響 105/ml濃度的 EMPs作用 HUVECs 12 h后，ICAM-1 mRNA和蛋白及磷酸化ERK1/2的表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，而阿托伐他汀及ERK1/2抑制劑PD98059則可明顯抑制ICAM-1 mRNA和蛋白的表達(dá)及ERK1/2的磷酸化(均P＜0.01)。見表2和圖2。

表1 不同濃度EMPs作用HUVECs后ICAM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)( s，n=6)

表1 不同濃度EMPs作用HUVECs后ICAM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)( s，n=6)

與空白對照及102/ml比較：1)P＜0.01;與103/ml比較：2)P＜0.01;與104/ml比較：3)P ＜0.01

EMPs濃度(個/ml)ICAM-1 mRNA ICAM-1蛋白(%)0＜0.01 ＜0.01 1.02±0.03 21.6±2.7 102 1.11±0.06 23.3±3.5 103 1.35±0.101) 40.8±6.01)104 1.83±0.161)2) 50.4±7.11)2)105 2.43±0.191)2)3) 69.9±8.21)2)3)H值 11.269 7.953 P值

圖1 不同濃度EMPs作用HUVEC后磷酸化ERK1/2的表達(dá)

表2 阿托伐他汀對ICAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響( s，n=6)

表2 阿托伐他汀對ICAM-1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響( s，n=6)

與空白對照組比較：1)P＜0.01;與 EMPs組比較：2)P＜0.01;與EMPs+阿托伐他汀0.1 μmol/L組比較：3)P＜0.01;與EMPs+阿托伐他汀1 μmol/L 組比較：4)P ＜0.01

組別 ICAM-1 mRNA ICAM-1蛋白(%)空白對照組＜0.01 ＜0.01 1.02±0.03 22.1±2.3 EMPs組 2.48±0.161) 71.2±9.31)EMPs+阿托伐他汀0.1 μmol/L組 2.23±0.152) 58.1±7.22)EMPs+阿托伐他汀1 μmol/L組 1.80±0.143) 44.5±6.83)EMPs+阿托伐他汀10 μmol/L組 1.53±0.114) 31.7±4.74)PD98059組 1.51±0.121) 33.6±5.01)H值 8.542 9.853 P值

圖2 阿托伐他汀對磷酸化ERK1/2表達(dá)的影響

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞分泌和釋放的活性物質(zhì)具有抗凝、抑制炎癥、調(diào)節(jié)血管張力等作用。研究表明，炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子以及促栓、促凋亡和氧化物質(zhì)等均可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的激活、損傷和凋亡，刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放EMPs〔5〕。正常健康者循環(huán)血中也可有EMPs的存在，在病理狀態(tài)下，特別是以內(nèi)皮損傷功能障礙為主要特征疾病，EMPs可明顯增高。研究表明，急性冠脈綜合征患者循環(huán)血EMPs明顯高于健康對照者和穩(wěn)定性心絞痛患者〔6〕，EMPs的數(shù)量與冠狀動脈粥樣硬化斑塊大小和嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)〔7〕。此外，在高血壓、糖尿病、血栓性疾病中也可發(fā)現(xiàn)EMPs的明顯增高〔8〕。因此，EMPs可作為反映心血管疾病內(nèi)皮功能狀態(tài)和嚴(yán)重程度的指標(biāo)。本研究通過用TNF-α可刺激HUVECs生成大量的EMPs，表明在一些疾病狀態(tài)下，TNF-α等炎性細(xì)胞因子增高可能在EMPs的生成中具有重要的作用。

更為重要的是，EMPs從內(nèi)皮細(xì)胞釋放的過程中，攜帶了大量的生物活性物質(zhì)如內(nèi)皮蛋白如血管內(nèi)皮鈣黏著蛋白、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1、內(nèi)皮膜糖蛋白、P-選擇素、細(xì)胞黏附分子CD146、整合素αV等〔1〕。因此，EMPs還可以作為生物信使分子參與介導(dǎo)血管炎癥、血栓形成、血管生成等生物學(xué)過程。EMPs不但是內(nèi)皮功能障礙的標(biāo)志物，更可能是導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的重要因素。本研究證實，與EMPs共孵育后，HUVECs表達(dá)ICAM-1呈劑量依賴性的增高。而ICAM-1等黏附分子，在單核/巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等接觸并黏附到損傷部位的血管內(nèi)皮，進(jìn)入動脈壁內(nèi)膜下間隙的過程中起重要的作用，參與了動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展。近年來研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ICAM-1等黏附分子還通過介導(dǎo)各種炎性細(xì)胞的趨化和聚集，參與了缺血再灌注和冠心病介入治療術(shù)后心肌損傷的過程〔9，10〕。因此，EMPs可能通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，參與了動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展和心肌損傷的過程。EMPs不僅是內(nèi)皮功能障礙的標(biāo)志物，也是動脈粥樣硬化和心肌損傷防治的潛在靶分子。

ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與內(nèi)皮炎癥反應(yīng)存在著密切的關(guān)系。研究表明，ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了HUVECs表達(dá)ICAM-1的調(diào)控〔11〕。本研究顯示，EMPs可誘導(dǎo)ICAM-1和磷酸化ERK1/2表達(dá)的明顯增高，而 ERK1/2特異性抑制劑PD98059可明顯抑制EMPs誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化和ICAM-1的表達(dá)。表明EMPs誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)ICAM-1與激活ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。大量的研究表明，阿托伐他汀除了具有調(diào)脂作用外，還具有抑制炎癥，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，延緩動脈粥樣硬化發(fā)展，穩(wěn)定斑塊，防治心肌損傷的作用〔2〕。本研究證實，阿托伐他汀可以明顯抑制EMPs誘導(dǎo)HUVECs ICAM-1的表達(dá)，且呈劑量依賴性。阿托伐他汀的作用主要通過抑制ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活實現(xiàn)。因此，阿托伐他汀可明顯抑制EMPs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)。

綜述所述，EMPs通過激活ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)HUVECs表達(dá)ICAM-1。阿托伐他汀抑制內(nèi)皮炎癥，抗動脈粥樣硬化及心肌保護(hù)作用可能部分與抑制EMPs的作用有關(guān)，EMPs是內(nèi)皮保護(hù)的新的靶分子。

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